豬脂肪干細胞源誘導性多能干細胞的獲取與鑒定.pdf

1、誘導性多能干細胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)的出現,為突破家畜胚胎干細胞(Embryonic stem cells,ESCs)研究瓶頸帶來了曙光,為獲取穩(wěn)定建系的家畜多能干細胞提供了一種可行的替代方案。遺憾的是,至今僅有極少數豬iPSCs能得到嵌合體后代或者核移植后代,并伴有高流產率、高死亡率和高畸形率等問題。因而,如何獲得高質量的豬iPSCs已成為該領域的研究熱點和難點。本研究探討了以豬

2、的脂肪干細胞(Adipose-derivedstemcells,ASCs)為源頭細胞開展重編程,旨在從源頭細胞類型上進一步優(yōu)化豬的體細胞重編程技術體系,以獲得安全、可靠的iPSCs系,為今后進行iPSCs克隆豬生產,豐富轉基因豬創(chuàng)制手段,或服務于人類iPSCs的安全性和有效性評價等奠定基礎。本研究共開展如下試驗。
　　試驗一:源頭細胞——豬ASCs的分離培養(yǎng)和生物學特征鑒定。我們通過膠原酶消化法從28日齡的長白豬皮下脂肪組織分離純

3、化出豬ASCs系,并進行了全面的鑒定。結果發(fā)現:豬的ASCs擁有很強的增殖活力,顯著高于取自同一頭豬的耳源成纖維細胞(Ear fibroblasts,EFs);ASCs在體外能夠進行長期傳代培養(yǎng),但擁有較高的異倍體率,且會隨著傳代周期而逐步上升;ASCs表達間充質干細胞特異性標記物CD44、CD90、CD29的比率依次為100％、96.5%、41.7%,而淋巴細胞標志物CD45、內皮細胞標志物CD31、成纖維細胞標記物HLA-DR的比率

4、依次為0.148%、0.404%、0.08%,可忽略不計,表明細胞純度很高;在體外合適的誘導條件下,ASCs縱向分化能夠產生油紅O染色陽性的成熟脂肪細胞,橫向分化能夠產生茜素紅染色陽性的成骨細胞鈣化結節(jié);ASCs中OCT4、SOX2、C-MYC、KLF4、NANOG以及LIN28基因均有內源性表達,但除了KLF4基因的表達量略高于相同代次EFs之外,其余幾個重編程轉錄因子在ASCs中的表達量很低甚至不表達;基因組DNA去甲基化中間產物5

5、-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hmC)在ASCs中的含量顯著高于相同代次的EFs(P<0.01)。上述結果表明,我們分離得到的豬ASCs系純度很高且具有可塑性;直接與重編程關聯的若干轉錄因子在ASCs中的本底表達水平很低;由于ASCs處于較低的甲基化修飾狀態(tài),從而有助于細胞多能性的重新獲得;ASCs的異倍體率較高,在使用前,需要對其進行正常核型細胞株的篩選。
　　試驗二:重編程豬ASCs,開展

6、iPSCs獲取和生物學特征鑒定。在借鑒小鼠與人無飼養(yǎng)層細胞、無血清條件下產生iPSCs策略的基礎上,以ASCs為源頭細胞,利用攜帶OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC四個外源重編程轉錄因子的藥物可誘導(RevTet-On)型慢病毒表達系統(tǒng)來進行無異源細胞影響下的重編程。結果如下:在有飼養(yǎng)層細胞存在的條件下,就AP陽性的ESCs樣克隆形成率而言,ASCs是EFs的6.28倍,而無飼養(yǎng)層細胞條件下,在AP陽性的ESCs樣克隆形成率方面,

7、ASCs是EFs的6.33倍;豬iPSCs培養(yǎng)液中添加特異性抑制絲裂原活化蛋白激酶激酶(Mitogen-activated protein kinase/Extracellular signal-regulated kinasekinase,MEK)信號通路和糖原合成酶-3(Glycogen synthase kinase-3,GSK3)信號通路的兩個小分子化合物(2i,即PD0325901和CHIR99021)后,豬iPSCs呈現出小

8、鼠ESCs的形態(tài)與傳代培養(yǎng)特征;慢病毒感染后,ASCs的異倍體率有升高的趨勢;ASCs來源的iPSCs克隆為AP陽性,同時這些克隆也都表達干細胞特異性標記物OCT4、SOX2、NANOG、SSEA-3以及SSEA-4;iPSCs中的關鍵轉錄因子OCT4、NANOG、DNMT3B、TERT基因被內源性激活,而其它的多能性基因LIN28、ESRRB、UTF1和DPPA5也被活化;iPSCs在體外能夠分化形成擬胚體,表達外、中、內三個胚層的標

9、記基因,體內能夠產生畸胎瘤;iPSCs在培養(yǎng)過程中,直接撤除強力霉素(Doxycycline)后,iPSCs會迅速發(fā)生分化。上述結果表明,豬ASCs用于重編程的效率顯著高于EFs(P<0.01),而且無飼養(yǎng)層、無血清條件下,豬ASCs能夠被成功誘導為iPSCs;慢病毒介導外源基因轉入可能導致iPSCs異倍體率上升;在重編程后期,2i處理能夠促進ASCs經過充分重編程而達到穩(wěn)定的多能性狀態(tài);在重編程過程中,形成的iPSCs已經產生對外源重