小鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞移植治療感音神經(jīng)性耳聾的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　感音神經(jīng)性耳聾是耳鼻喉科的常見疾病，其主要原因是由內(nèi)耳毛細(xì)胞和/或螺旋神經(jīng)元的損傷導(dǎo)致，然而在哺乳動(dòng)物，以上二者的損傷是不可能再生與修復(fù)的，因此干細(xì)胞移植替代受損的毛細(xì)胞和/或螺旋神經(jīng)元治療由此引起的感音神經(jīng)性耳聾已成為耳科學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)問題。
　　目的：
　　1.通過體外培養(yǎng)建立穩(wěn)定的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSCs）培養(yǎng)體系；
　　2.利用耳毒性藥物制作小鼠感音神經(jīng)性耳聾模型；
　　3.

2、利用顯微注射法將經(jīng)CM-Di1標(biāo)記的iPSCs經(jīng)圓窗移植入小鼠耳蝸，觀察移植細(xì)胞在耳蝸內(nèi)的存活、遷移、分化情況，為利用iPSCs移植治療感音神經(jīng)性耳聾提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.iPSCs的培養(yǎng)與標(biāo)記：利用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)穩(wěn)定傳代的小鼠 iPSCs，并用熒光染料CM-Di1標(biāo)記。
　　2.感音神經(jīng)性耳聾模型的制作：利用幼鼠皮下連續(xù)注射新霉素，通過聽性腦干反應(yīng)檢測(cè)小鼠聽力損失情況。
　　3.小鼠iPSCs耳蝸

3、移植：取40只造模成功小鼠隨機(jī)平均分為實(shí)驗(yàn)組A和對(duì)照組B，同時(shí)取20只同批次正常小鼠作為正常組C，A組利用顯微注射法將標(biāo)記的小鼠iPSCs經(jīng)圓窗移植入耳聾鼠耳蝸的Rosenthal’s管中，B組注射等量的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，4周后處死A、B、C組小鼠各10只，通過免疫熒光染色法和RT-PCR法觀察移植細(xì)胞在耳蝸內(nèi)的存活、遷移與分化情況。剩余小鼠用于ABR閾值的連續(xù)性觀察。
　　4. iPSCs移植后耳蝸HE染色鑒定是否有畸胎瘤形成

4、。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立穩(wěn)定的小鼠iPSCs培養(yǎng)體系，并能在體外培養(yǎng)形成EB，RT-PCR可檢測(cè)iPSCs多能性基因Nanog,Oct4,Sox2。
　　2.連續(xù)皮下注射新霉素12天后，小鼠反應(yīng)閾達(dá)70-80dBnHL。
　　3.A組和B組術(shù)后ABR閾值無改善。A組蝸軸和Rosenthal’s管中均可見紅色標(biāo)記的iPSCs，并且部分細(xì)胞表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)記物和螺旋神經(jīng)元標(biāo)記物。B、C組耳蝸內(nèi)未見紅色熒光表達(dá)。<

5、br>　　4.各組小鼠術(shù)前、術(shù)后ABR閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.HE染色鑒定iPSCs移植后耳蝸暫未見畸胎瘤形成。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)可成功建立穩(wěn)定的小鼠iPSCs培養(yǎng)體系。
　　2.CM-Di1可用于體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染和體內(nèi)細(xì)胞的示蹤。
　　3.新霉素可誘導(dǎo)小鼠感音神經(jīng)性耳聾，建立穩(wěn)定的耳聾模型。
　　4.小鼠iPSCs耳內(nèi)移植后可分化為表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)志物的毛細(xì)胞樣細(xì)胞。
　　5.小鼠i