基于小鼠胚胎干細(xì)胞和人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞分別建立發(fā)育毒性模型及應(yīng)用的研究.pdf

1、[目的]：
　　發(fā)育毒性的評(píng)價(jià)方法存在許多難點(diǎn)和重點(diǎn)問題，仍不能完全正確反映出各種外源物在人胚胎發(fā)育過程中的毒性等級(jí)。本論文旨在一是建立有效的多分子終點(diǎn)法的胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)(embryonic stem cell test，EST)，對(duì)明確體內(nèi)胚胎發(fā)育毒性的各種受試物進(jìn)行研究評(píng)價(jià);二是基于人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(human inducedpluripotent stem cell，hiPSC)建立科學(xué)有效的篩選評(píng)價(jià)發(fā)育毒性的體外模型即人

2、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞試驗(yàn)(human induced pluripotent stem cell test，hiPST);三是應(yīng)用上述經(jīng)證實(shí)有效可靠的發(fā)育毒性體外模型評(píng)價(jià)白藜蘆醇和甲殼低聚糖的發(fā)育毒性，為白藜蘆醇和甲殼低聚糖的應(yīng)用提供詳實(shí)的發(fā)育毒性數(shù)據(jù)。
　　[方法]：
　　1.各種受試物設(shè)置不同濃度組，MTT法分別檢測(cè)各受試物不同濃度對(duì)3T3細(xì)胞、小鼠胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell，ESC)、人皮膚成纖維細(xì)

3、胞(Humansapiens fibroblast cell，HSF)、hiPSC的細(xì)胞毒性，于490 nm處測(cè)量其吸光度OD值，并繪成濃度-反應(yīng)曲線，求出相對(duì)應(yīng)的產(chǎn)生細(xì)胞半數(shù)致死量的受試物濃度即IC503T3、 IC50HSF、IC50ESC、IC50hiPSC。
　　2.在含有受試物不同濃度的分化培養(yǎng)液中懸滴法培養(yǎng)ESC，懸浮法培養(yǎng)hiPSC，以形成擬胚體(Embryonic body, EB)，然后轉(zhuǎn)移EB至含有相同濃度受試

4、物的分化培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)繼續(xù)分化，各濃度組EB數(shù)量相同。
　　3.分化第10天或者第15天時(shí)，Real-time PCR檢測(cè)受試物各濃度分化組細(xì)胞的特異基因表達(dá)，得到半數(shù)抑制分化的受試物濃度ID50值。
　　4.將三個(gè)終點(diǎn)IC503T3、IC50ESC、ID50ESC，另外三個(gè)終點(diǎn)IC50HSF、IC50hiPSC、ID50hiPSC代入特定函數(shù)公式計(jì)算，評(píng)價(jià)結(jié)果與各受試物體內(nèi)發(fā)育毒性數(shù)據(jù)比較，判斷EST和hiPST是否成功

5、建立。
　　[結(jié)果]：
　　1.各受試物細(xì)胞毒性終點(diǎn)IC503T3、IC50ESC，胚胎毒性終點(diǎn)ID50ESC代入函數(shù)公式計(jì)算后，評(píng)價(jià)發(fā)育毒性結(jié)果分別為青霉素?zé)o毒性、糖精鈉無毒性，丙戊酸弱毒性、氯化鋰弱毒性，5-氟尿嘧啶強(qiáng)毒性、羥基脲強(qiáng)毒性，與體內(nèi)胚胎發(fā)育毒性等級(jí)相符合。
　　2.IC50HSF、IC50hiPSC、ID50hiPSC代入函數(shù)公式計(jì)算后，評(píng)價(jià)發(fā)育毒性結(jié)果分別為青霉素?zé)o毒性、5-氟尿嘧啶強(qiáng)毒性。與體內(nèi)胚胎

6、發(fā)育毒性等級(jí)相符合。
　　3.經(jīng)EST和hiPST分別評(píng)價(jià)，白藜蘆醇和甲殼低聚糖均呈無毒性。
　　[結(jié)論]：
　　1.本實(shí)驗(yàn)基于ESC建立的分子終點(diǎn)EST是有效的，且涵蓋了早中晚發(fā)育的多個(gè)早期胚胎發(fā)育階段終點(diǎn)。
　　2.本實(shí)驗(yàn)基于hiPSC已建立科學(xué)有效的用于評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)發(fā)育毒性的體外替代模型。
　　3.用EST和hiPST評(píng)價(jià)了白藜蘆醇和甲殼低聚糖的發(fā)育毒性，為白藜蘆醇和甲殼低聚糖的應(yīng)用提供了準(zhǔn)確可靠的發(fā)育毒