譜系重編程獲取內(nèi)胚層祖細(xì)胞及其向功能性肝細(xì)胞的誘導(dǎo)分化.pdf

1、肝臟是人體內(nèi)負(fù)責(zé)蛋白合成、代謝物轉(zhuǎn)化和異源物質(zhì)解毒等重要功能的內(nèi)臟器官，由肝臟代謝性疾病和爆發(fā)性肝衰竭等引起的終末期肝病是嚴(yán)重危害全世界人類健康的重大疾病之一。目前治療終末期肝病的唯一有效手段是肝移植，但面臨著供體肝臟稀缺和免疫排斥等問題。盡管以肝細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞替代治療以及生物人工肝和組織工程肝臟等輔助治療設(shè)備已被廣泛地應(yīng)用于終末期肝病的臨床治療中，卻也同樣受到了功能性肝細(xì)胞來源問題的嚴(yán)重制約。近年來，干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展為終末

2、期肝病等重大疾病的細(xì)胞治療帶來了新的希望。
　　多能干細(xì)胞（Pluripotent stem cells，PSCs）包括胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cells，ESCs）和誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs），具有高度自我更新能力和向幾乎所有細(xì)胞類型分化的潛能，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。人們模擬胚胎發(fā)育過程，利用各發(fā)育階段所需的細(xì)胞因子能夠?qū)⒍嗄芨杉?xì)胞誘導(dǎo)分化成肝

3、細(xì)胞，這些研究為多能干細(xì)胞來源的肝細(xì)胞應(yīng)用于終末期肝病的治療帶來了希望，但是仍然存在很多問題。首先，ESCs和iPSCs都有成畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)，這是 ESCs或 iPSCs來源的功能細(xì)胞應(yīng)用于臨床治療存在的一個(gè)重要安全隱患。其次，目前大部分干細(xì)胞來源的肝細(xì)胞表型均與未成熟胎肝細(xì)胞相似，無法達(dá)到原代成年肝細(xì)胞的成熟度。此外，ESCs和iPSCs的全能性導(dǎo)致在向所需細(xì)胞類型分化的過程中會(huì)同時(shí)產(chǎn)生各種其他胚層的細(xì)胞類型，難以獲得高純度、單一譜系的

4、目的細(xì)胞。
　　基于iPSCs重編程的思路，人們建立了將一種細(xì)胞直接重編程為另一種細(xì)胞類型的方法，即譜系重編程技術(shù)。近期有多個(gè)團(tuán)隊(duì)分別從對(duì)肝臟發(fā)育成熟非常關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子中篩選出不同轉(zhuǎn)錄因子組合，通過在成纖維細(xì)胞中過表達(dá)這些轉(zhuǎn)錄因子，成功地實(shí)現(xiàn)了人和小鼠來源成纖維細(xì)胞向肝細(xì)胞以及小鼠成纖維細(xì)胞向肝干細(xì)胞的直接細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化。此外，還可以通過瞬時(shí)表達(dá)多能性轉(zhuǎn)錄因子先將成纖維細(xì)胞重編程到內(nèi)胚層祖細(xì)胞階段，再利用細(xì)胞因子和小分子化合物將其分

5、化成肝細(xì)胞。這些完全或部分依賴于轉(zhuǎn)錄因子的重編程策略為基于細(xì)胞的臨床治療帶來了希望，但是對(duì)基因進(jìn)行操作的方式所存在的潛在風(fēng)險(xiǎn)限制了其臨床應(yīng)用。
　　小分子化合物具有穩(wěn)定、可控、廉價(jià)和安全的特性，在細(xì)胞重編程中的應(yīng)用非常廣泛。單純使用小分子化合物實(shí)現(xiàn)了小鼠成纖維細(xì)胞向iPSCs的重編程以及小鼠和人的成纖維細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)化，這種完全使用化合物的重編程方式為細(xì)胞重編程提供了更為安全穩(wěn)定的策略。然而，目前為止人們?nèi)晕茨軌驅(qū)崿F(xiàn)利用小

6、分子化合物重編程的方式獲得任何一個(gè)胚層的干/祖細(xì)胞。
　　在本研究中，我們選取與肝臟發(fā)育同源的消化道上皮細(xì)胞作為起始細(xì)胞，利用小分子化合物將其重編程為誘導(dǎo)人內(nèi)胚層祖細(xì)胞（Human induced endodermal progenitor cells，hiEndoPCs），然后將hiEndoPCs誘導(dǎo)分化為功能性肝細(xì)胞。我們首先建立了從胃腸手術(shù)或胃腸鏡活檢標(biāo)本中分離培養(yǎng)原代上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的方法。發(fā)現(xiàn)在胃基質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞

7、的支持作用下，利用 Bay K8644、Bix01294、RG108和SB431542這四個(gè)小分子化合物的組合能夠?qū)⑽干掀ぜ?xì)胞和十二指腸上皮細(xì)胞高效地譜系重編程為hiEndoPCs。hiEndoPCs表達(dá)內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞標(biāo)志性基因GATA4、FOXA2、SOX9、HNF1B、PDX1、ONECUT2和HOXA3，且在全基因組轉(zhuǎn)錄水平和表觀遺傳水平上具有內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞特性，hiEndoPCs可能是一種發(fā)育階段介于原腸管（Primitiv

8、e gut tube，PGT）和后腸后段（Posterior foregut，PFG）之間的特殊的內(nèi)胚層祖細(xì)胞。hiEndoPCs在體外具有一定的增殖能力，能夠在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)條件下進(jìn)行傳代和擴(kuò)增，經(jīng)過凍存和復(fù)蘇后hiEndoPCs能夠維持其生長特性和分化潛能。
　　在肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化條件下，hiEndoPCs可以在體外分化為表達(dá)成熟肝細(xì)胞標(biāo)志性基因的肝細(xì)胞樣細(xì)胞（hiEndoPC-Heps）。DNA甲基化分析顯示TF、CYP2E1、

9、APOBEC1等肝系特異性基因的啟動(dòng)子區(qū)域在hiEndoPC-Heps中處于低甲基化狀態(tài)。RNA-seq數(shù)據(jù)顯示在hiEndoPC-Heps中有大量與肝臟發(fā)育和成熟、脂肪酸代謝、葡萄糖代謝、脂蛋白代謝以及藥物代謝相關(guān)的基因表達(dá)顯著上調(diào)。更重要的是，hiEndoPC-Heps在體外具有糖原和脂滴儲(chǔ)存、靛青綠和低密度脂蛋白攝取、白蛋白分泌和 CYP3A4代謝等肝細(xì)胞功能，而且在體內(nèi)能夠整合到肝損傷小鼠肝臟中并發(fā)揮生物學(xué)功能。
　　hi

10、EndoPCs在體外還能夠誘導(dǎo)分化形成表達(dá)胰腺發(fā)育關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子NKX6.1、PDX1、NGN3和胰腺特異性基因GCG、INS、SST的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞，以及表達(dá)CDX2、VIL1、MUC2、CHGA和LYSO的腸上皮細(xì)胞。此外，hiEndoPCs還具有向肺上皮細(xì)胞和甲狀腺上皮細(xì)胞分化的潛能。然而hiEndoPCs在體內(nèi)和體外均不具備向中胚層和外胚層分化的潛能，表明其分化潛能限制在內(nèi)胚層。最后，我們對(duì)hiEndoPCs的安全性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，