DMD病人特異性iPSCs誘導及hESCs向限定性內(nèi)胚層細胞分化的研究.pdf

1、胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）和誘導多潛能性干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)為基因修飾以及基因治療提供了一種新型的研究工具。將基因修正后的人類多潛能性干細胞細胞經(jīng)過自體移植，可實現(xiàn)某些遺傳疾病治療的目的。我室一直致力于杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)及血友病A的基因治療研究。作為基因治療的靶細胞，解決iPS細胞的來源是進行后續(xù)研究得以順利開展的基礎。本研究第一章

2、內(nèi)容擬將病人來源的尿液細胞誘導為iPS細胞，為后續(xù)DMD病人的自體化基因治療提供合適的細胞來源。第二章研究內(nèi)容擬利用我室之前建立的定點整合hFⅧ的人胚胎干細胞細胞株ET5作為研究對象，初步建立hESCs向限定性內(nèi)胚層細胞(Definitive endoderm cells，DECs)分化的技術(shù)平臺，從而為后續(xù)血友病A的治療中肝細胞的來源提供一種解決思路。
　　第一章:DMD病人尿液細胞向iPSCs的誘導與初步鑒定。
　　目的

3、:利用DMD病人尿液來源的細胞獲得病人特異性iPSCs。
　　方法:1.收集DMD基因50號外顯子缺失的DMD病人尿液，分離并培養(yǎng)尿液細胞中腎小管上皮細胞。
　　2.利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4四種轉(zhuǎn)錄因子導入尿液細胞，經(jīng)過20天左右的誘導，獲得形態(tài)與hESCs細胞系高度相似的細胞克隆。
　　3.對所得的細胞克隆進行多潛能性干細胞的表面標志物、堿性磷酸酶、細胞核型及體外隨機分化的鑒定。

4、>　　結(jié)果:1.經(jīng)上述方法誘導可獲得尿液細胞來源的iPSCs樣細胞系，MLPA檢測誘導后iPSCs基因組DMD基因50號外顯子缺失;
　　2.誘導iPSCs細胞堿性磷酸酶染色陽性，且干細胞表面標志物表達與hESCs一致;細胞染色體核型顯示無染色體水平的畸變;體外EB形成檢測誘導的iPSCs可分化出表達內(nèi)、中胚層特異標志物的細胞。
　　結(jié)論:建立了DMD基因50號外顯子缺失的iPS細胞系。
　　第二章:hESCs向限定性

5、內(nèi)胚層細胞的誘導分化。
　　目的:初步建立hESCs定向限定性內(nèi)胚層細胞誘導分化以及鑒定的技術(shù)平臺。
　　方法:1.聯(lián)合BMP4、Activin A、chir99021誘導ET5向限定性內(nèi)胚層細胞分化;
　　2.分化過程的第一天和第五天抽提分化細胞的RNA，RT-PCR檢測內(nèi)胚層標志基因Sox17，F(xiàn)oxA2的表達情況;
　　3.分化五天后流式分析DE細胞表面特異標志物c-kit(CD117)、CXCR4(CD1

6、84)的表達。
　　結(jié)果:1.聯(lián)合高濃度Activin A、BMP4、chir99021對ET5誘導5天，分化第二天即可在ET5克隆中觀察到上皮樣細胞的出現(xiàn)。
　　2.分別抽提分化過程當中第一天和第五天的細胞的RNA，RT-PCR分析可檢測到Sox17，F(xiàn)oxA2的表達。
　　3.誘導五天后，流式分析DE細胞表面共表達c-kit、CXCR4陽性率達到39.01％。
　　結(jié)論:初步建立hESCs向限定性內(nèi)胚層細胞分