骨髓樹突狀細胞誘導(dǎo)抗原特異性調(diào)節(jié)性T細胞的實驗研究.pdf

1、[目的]
　　 以小鼠骨髓源性樹突狀細胞(Bone marrow-derived DCs，BM-DCs)與異基因小鼠脾CD4+T細胞混合培養(yǎng)，以誘導(dǎo)抗原特異性調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory Tcells，Tregs)的產(chǎn)生。
　　 [方法]
　　 (1)成熟樹突狀細胞的誘導(dǎo)：從小鼠雙側(cè)股骨提取骨髓細胞，在GM-CSF及IL-4協(xié)同刺激下培養(yǎng)，第7天收獲半貼壁的骨髓未成熟樹突狀細胞(immatureDCs，im

2、DCs)，imDCs于第6天用LPS誘導(dǎo)16小時獲得成熟樹突狀細胞(matureDCs，mDCs)。
　　 (2)Tregs的誘導(dǎo)：免疫磁珠法分選BALB/C小鼠脾CD4+T細胞并分別與異基因C57BL/6小鼠及同基因BALB/C小鼠不同成熟狀態(tài)的DCs混合培養(yǎng)以誘導(dǎo)Tregs的產(chǎn)生，5天后，以流式細胞儀檢測各實驗組誘導(dǎo)的Tregs(induced Tregs，iTregs)的CD25及FOXP3的表達。
　　 (3)不

3、同方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的Tregs體外淋巴細胞增殖抑制試驗：以BALB/C小鼠CD4+CD25-T作為增殖反應(yīng)細胞，C57BL/6小鼠的脾細胞為刺激細胞，加入不同數(shù)量的同基因或異基因DCs誘導(dǎo)的BALB/C小鼠Tregs作為淋巴細胞增殖抑制的效應(yīng)細胞，以CFSE標記增殖反應(yīng)細胞，用流式細胞儀(FCM)檢測分析增殖抑制效應(yīng)；并與新鮮分離的CD4+CD25+天然調(diào)節(jié)性T細胞(naturallyoccurring regulatory T cells

4、，nTregs)的增殖抑制效應(yīng)比較。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)mDCs誘導(dǎo)：每只小鼠的雙側(cè)股骨可以得到2.50×106～3.50×106個DCs，在光學(xué)顯微鏡下觀察具有典型DCs形態(tài)的細胞比例在60.0％～，90.0％，CD11C的表達率在imDCs和mDCs上基本相同，均大于80.0％，imDCs的CD86表達陽性率較mDCs低，分別為(9.90±0.99)％和(40.27±2.50)％。
　　 (2)Tr

5、egs的誘導(dǎo)：經(jīng)異基因imDCs和mDCs的刺激，BALB/C小鼠CD4+T細胞中的FOXP3表達陽性率從(6.33±0.52)％分別提高到(24.89±2.67)％和(38.75±2.02)％(P<0.01)；經(jīng)同基因imDCs和mDCs刺激，BALB/C小鼠的CD4+T細胞中的FOXP3表達陽性率從(6.33±0.52)％分別提高到(9.30±0.56)％和(9.65±0.92)％(P<0.05)。
　　 (3)不同方法誘導(dǎo)

6、產(chǎn)生的iTregs體外淋巴細胞增殖抑制試驗：抑制實驗根據(jù)Tregs來源分為三組，即異基因DCs誘導(dǎo)的iTregs組(allo-Tregs組)、同基因DCs誘導(dǎo)的iTregs組(auto-Tregs組)及新鮮分離的nTregs組(nTreg組)。各組不同來源的Tregs作為增殖抑制細胞分別與CD4+CD25-增殖反應(yīng)細胞以1:1、1:2、1:4比例混合培養(yǎng)，CFSE法檢測CD4+CD25-T細胞增殖前體頻率(PF)分別為(8.70±1.5

7、7)％、(11.67±1.37)％、(16.67±1.72)％；52.40±2.51、56.27±1.12、60.67±1.53及(16.47±2.11)％、(21.70±2.35)％、(28.20±2.55)％。三組間兩兩比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。用CCK8法檢測，上述三組的CD4+CD25-T細胞增殖指數(shù)(SI)分別是0.57±0.12、3.06±0.06、4.25±0.13；5.59±0.446、6.18±0.16

8、、6.37±0.13及1.51±0.07、3.48±0.03、5.13±0.32。三組間兩兩比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。
　　 [結(jié)論]
　　 (1)通過聯(lián)合使用GM-CSF和IL-4，能從小鼠骨髓中誘導(dǎo)大量的imDCs，經(jīng)過LPS刺激，imDCs可以被進一步誘導(dǎo)成熟。
　　 (2)異基因DCs誘導(dǎo)的CD4+CD25+Tregs的FOXP3表達水平比同基因DCs誘導(dǎo)的水平顯著增高，可能因為CD4+T