抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增.pdf

1、[目的]培養(yǎng)擴(kuò)增出抗原特異性CD4+CD25+Treg細(xì)胞，并觀察其免疫抑制功能，為今后臨床利用抗原特異性CD4+CD25+Treg細(xì)胞誘導(dǎo)器官移植免疫耐受提供新思路。
　　 [方法]本實驗分兩部分:
　　 第一部分，提取小鼠脾臟CD4+CD25+Treg細(xì)胞:利用免疫磁珠分選系統(tǒng)分選Balb/c小鼠脾臟的CD4+CD25+Treg細(xì)胞，包括陰性分選獲得CD4+T細(xì)胞，陽性分選獲得CD4+CD25+Treg細(xì)胞。并用流式

2、細(xì)胞儀檢測分選后細(xì)胞的純度及Foxp3表達(dá)率。
　　 第二部分，培養(yǎng)擴(kuò)增抗原特異性CD4+CD25+Treg細(xì)胞:①提取C57小鼠脾細(xì)胞，經(jīng)絲裂霉素C滅活后與提取的Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg細(xì)胞(10∶1)于96孔培養(yǎng)板中混合培養(yǎng)，培養(yǎng)基選用RPMI1640完全培養(yǎng)基，配以10％胎牛血清、rmIL-22000U/mL、雷帕霉素100nmol/mL，37℃、5％CO2、100％濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天，第3、5、7、

3、9、11天換液，第14天收集細(xì)胞;②T細(xì)胞增殖抑制實驗，檢測培養(yǎng)后CD4+CD25+Treg的抗原特異性。實驗分成四組:第一組（實驗組）:C57小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞+培養(yǎng)后的Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg+C57小鼠脾細(xì)胞;第二組（對照組）:C57小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞+未培養(yǎng)的Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg+C57小鼠脾細(xì)胞;第三組（空白對照組）:C57小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞+C57小鼠脾細(xì)

4、胞;第四組（第三方對照組）:昆明小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞+培養(yǎng)后的Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg+C57小鼠脾細(xì)胞。通過觀察比較各組CD4+CD25-T細(xì)胞增殖情況的不同判斷擴(kuò)增出來的CD4+CD25+Treg是否有抗原特異性。③不同濃度CD4+CD25+Treg對T細(xì)胞的增殖抑制試驗:將培養(yǎng)后的Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg與C57小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞分別按0.5∶1、1∶1、2∶1、4∶1、8∶1

5、混合培養(yǎng)，觀察各孔中CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖情況。④數(shù)據(jù)用統(tǒng)計軟件SPSS14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。正態(tài)分布的變量，兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗;非正態(tài)分布變量比較采用秩和檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。
　　 [結(jié)果]
　　 第一部分:利用免疫磁珠分選系統(tǒng)，經(jīng)陰性分選及陽性分選，可分選出純度達(dá)90％的CD4+CD25+Treg細(xì)胞，F(xiàn)oxp3表達(dá)率達(dá)95％以上，其分離方法穩(wěn)定、高效，可用于進(jìn)行相關(guān)研究。
　

6、　 第二部分:
　　 1.C57小鼠特異性CD4+CD25+Treg細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增:Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg細(xì)胞加入C57小鼠脾細(xì)胞(1∶10)，經(jīng)過14天培養(yǎng)后，Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg細(xì)胞約擴(kuò)增10倍。
　　 2.T細(xì)胞增殖抑制試驗:各組培養(yǎng)72小時后，流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示:①實驗組中C57小鼠原代CD4+CD25T細(xì)胞比例明顯比對照組中的高(86.0％±3.9％VS.40.6％

7、±1.9％，P＜0.05)，因此利用C57小鼠脾細(xì)胞擴(kuò)增出的Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg細(xì)胞比新鮮提取的Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg細(xì)胞對C57小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞抑制作用強(qiáng)。②實驗組中C57小鼠原代CD4+CD25-T細(xì)胞比例明顯比空白對照組中的高（86.0％±3.9％VS.6.8％±3.4％，P＜0.05），對照組中C57小鼠原代CD4+CD25-T細(xì)胞比例也比空白對照組中的高（40.6％±1.9

8、％％VS.6.8％±3.4％，P＜0.05）?？傻贸鼋Y(jié)論，新鮮提取和利用C57小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)后的Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg細(xì)胞對C57小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞均有抑制作用。③實驗組中C57小鼠原代CD4+CD25-T細(xì)胞比例明顯比第三方對照組中的高（86.0％±3.9％VS.33.5％±3.0％，P＜0.05），說明利用C57小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)后的Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg細(xì)胞對昆明小鼠CD4+CD25-

9、T細(xì)胞的抑制作用不如對C57小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞的抑制作用。因此，培養(yǎng)后CD4+CD25+Treg并非抑制作用加強(qiáng)，其對C57小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)是特異性的。由此得出結(jié)論:CD4+CD25+Treg細(xì)胞對同種異體CD4+CD25-T細(xì)胞均有一定的抑制作用，利用脾細(xì)胞可以培養(yǎng)擴(kuò)增出抗原特異性CD4+CD25+Treg細(xì)胞。
　　 3.不同濃度抗原特異性CD4+CD25+Treg細(xì)胞的T細(xì)胞增殖抑制試驗

10、:培養(yǎng)48h后，各孔原代CD4+CD25-T細(xì)胞比例分別為:11.1％、14.1％、23.1％、40.6％、49.6％。因此，隨著CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例的增高，其抑制作用是隨之增強(qiáng)的。
　　 [結(jié)論]
　　 1.本實驗利用免疫磁珠分選系統(tǒng)，經(jīng)過陰性分選和陽性分選兩步法，得到高純度的CD4+CD25+Treg細(xì)胞，此方法是理想的體外分離CD4+CD25+Treg細(xì)胞方法。
　　 2.本實驗利用脾細(xì)胞成功

11、培養(yǎng)擴(kuò)增了具有抗原特異性的CD4+CD25+Treg細(xì)胞，此方法經(jīng)濟(jì)、簡單、實用。
　　 3.本實驗驗證了CD4+CD25+Treg細(xì)胞對效應(yīng)性T細(xì)胞的抑制作用，并證明這種抑制作用存在于同種異體之間，但其對特定抗原的抑制作用不如抗原特異性CD4+CD25+Treg細(xì)胞。
　　 4.本實驗還證明，抗原特異性CD4+CD25+Treg細(xì)胞對效應(yīng)性T細(xì)胞的免疫抑制作用受二者比例的影響，隨著CD4+CD25+Treg比例的增高，