誘導(dǎo)產(chǎn)生受者抗原特異性Tregs細(xì)胞及其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、目的：通過體外抑制實(shí)驗(yàn)和建立小鼠異基因骨髓移植移植物抗宿主病(GVHD)動(dòng)物模型比較具備特異性抗原識(shí)別功能與不具備特異性抗原識(shí)別功能Tregs的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，為受者抗原特異性Tregs應(yīng)用于臨床免疫治療提供有力證據(jù)。
　　 方法：⑴BM-DCs分離培養(yǎng)及鑒定:分別從BALB/C小鼠、C57BL/6小鼠、C3H/HeNCrlVr小鼠的雙側(cè)股骨中分離樹突狀細(xì)胞(BM-DCs)，于含10％胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基、重組鼠GM-CS

2、F、IL-4培養(yǎng)6天，加入LPS繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)后收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD11C及CD86分子的表達(dá)。⑵從CD4+T細(xì)胞中誘導(dǎo)擴(kuò)增Tregs及Tregs的抗原表達(dá)鑒定:用免疫磁珠分選法從BALB/C小鼠脾細(xì)胞中分選CD4+T細(xì)胞，分別與BALB/C小鼠、C57BL/6小鼠、C3H/HeNCrlVr小鼠的DCs混合，并加入IL-2和雷帕霉素(RAPA)培養(yǎng)擴(kuò)增5天后，收獲細(xì)胞并以流式細(xì)胞儀檢測擴(kuò)增的細(xì)胞CD25及FOXP3的

3、表達(dá)。⑶以C57BL/6小鼠的脾淋巴細(xì)胞作為刺激細(xì)胞、以CFSE標(biāo)記的BALB/C小鼠新鮮分離的CD4+CD25T細(xì)胞作為增殖效應(yīng)細(xì)胞，共同培養(yǎng)于96孔圓底板進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，同時(shí)分別加入不同數(shù)量的新鮮分離nTregs和不同DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的iTregs進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，在反應(yīng)5天后收集細(xì)胞以流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖效應(yīng)。比較用CD4CD25免疫磁珠分選試劑盒分選獲得的新鮮分離CD4+CD25+細(xì)胞(nTregs

4、)與不同DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞(iTregs)對(duì)效應(yīng)性T細(xì)胞（Teffs）的增殖抑制效應(yīng)。⑷建立小鼠異基因移植GVHD模型:以C57BL/6(H-2b)雄性小鼠為供鼠、8-10周齡SPF級(jí)BALB/c(H-2d)小鼠為受鼠，受鼠接受劑量率0.5 Gy/min、總劑量8.0 Gy的全身照射(TBI)預(yù)處理后，以1∶1比例輸入供鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞及脾淋巴細(xì)胞建立小鼠異基因移植GVHD模型。⑸比較不同DC誘導(dǎo)產(chǎn)生和新鮮

5、分離的CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞對(duì)移植效應(yīng)的影響:受鼠于移植0天、+1天、+3天和+5經(jīng)尾靜脈分別輸入新鮮分選的同基因(H-2d)小鼠、異基因(H-2b)小鼠的nTregs和不同DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的iTregs治療GVHD，觀察移植受鼠GVHD發(fā)生率、長期存活率、植入及造血重建等移植效應(yīng)。
　　 結(jié)果：①新鮮分選和不同DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+CD25+T細(xì)胞FOXP3表達(dá)檢測:經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，免疫磁珠法新鮮分選的CD4+CD2

6、5+細(xì)胞FOXP3陽性表達(dá)率為5％;經(jīng)BALB/C、C57BL/6和C3H/HeNCrlVr小鼠DCs誘導(dǎo)培養(yǎng)BALB/C小鼠脾CD4+T細(xì)胞獲得的CD4+CD25+細(xì)胞FOXP3陽性表達(dá)率分別為14.7％、12.7％和19.7％;經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，3種不同基因小鼠DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+CD25+T細(xì)胞FOXP3表達(dá)均較新鮮分離的CD4+CD25+細(xì)胞增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);但3種不同基因小鼠DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+CD25+

7、細(xì)胞之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。②不同Tregs對(duì)體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制試驗(yàn):新鮮分離的同基因(H-2d)和異基因(H-2b)小鼠nTregs對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。異基因(H-2b)小鼠DCs誘導(dǎo)的iTregs對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制率比2種新鮮分離的nTregs明顯增高（P＜0.05）;而同基因(H-2d)和第三方(C3 H/HeNCrlVr)小鼠DCs誘導(dǎo)的iTregs對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的

8、抑制率則比2種新鮮分離的nTregs降低(P＜0.05)。③不同Tregs對(duì)小鼠異基因骨髓移植效應(yīng)的影響:注射骨髓細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞的小鼠全部移植成功，均出現(xiàn)GVHD的臨床表現(xiàn)如弓背、脫毛、體重下降及肝臟、脾臟、小腸組織GVHD病理學(xué)改變。各組受鼠GVHD嚴(yán)重程度比較:GVHD組＞allo-nTregs(C57BL/6)組＞allo-iTregs(C3H)組＞auto-nTreg(BALB/C)組＞auto-iTreg(BALB/C)組＞

9、allo-iTregs(C57BL/6)組;各組受鼠移植+60天存活率:GVHD組和allo-nTregs(C57BL/6)組均無存活，auto-nTreg(BALB/C)組及allo-iTregs(C3H)組均為20％，auto-iTreg(BALB/C)及allo-iTregs(C57BL/6)組均為40％。注射Tregs顯著延長GVHD小鼠的存活期(P＜0.05)，注射具有抗原特異性的Tregs的小鼠存活率、嵌合體比例及外周血淋巴

10、細(xì)胞CD4+CD25+FOXP3+表達(dá)均比注射新鮮分離的nTregs和非抗原特異性Tregs的小鼠高(P＜0.05)，而外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)無明顯變化(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：⑴不同DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的iTregs中FOXP3表達(dá)比新鮮分選的nTregs中FOXP3表達(dá)高。⑵不同DC誘導(dǎo)產(chǎn)生和新鮮分離的CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞均能抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中CD4+CD25-T效應(yīng)細(xì)胞的增殖效應(yīng)。異基因DCs誘導(dǎo)產(chǎn)生的iTreg