誘導產生受者抗原特異性Tregs細胞及其免疫調節(jié)機制研究.pdf

1、目的：通過體外抑制實驗和建立小鼠異基因骨髓移植移植物抗宿主病(GVHD)動物模型比較具備特異性抗原識別功能與不具備特異性抗原識別功能Tregs的免疫調節(jié)效應，為受者抗原特異性Tregs應用于臨床免疫治療提供有力證據。
　　 方法：⑴BM-DCs分離培養(yǎng)及鑒定:分別從BALB/C小鼠、C57BL/6小鼠、C3H/HeNCrlVr小鼠的雙側股骨中分離樹突狀細胞(BM-DCs)，于含10％胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基、重組鼠GM-CS

2、F、IL-4培養(yǎng)6天，加入LPS繼續(xù)培養(yǎng)16小時后收集細胞，用流式細胞儀檢測細胞表面CD11C及CD86分子的表達。⑵從CD4+T細胞中誘導擴增Tregs及Tregs的抗原表達鑒定:用免疫磁珠分選法從BALB/C小鼠脾細胞中分選CD4+T細胞，分別與BALB/C小鼠、C57BL/6小鼠、C3H/HeNCrlVr小鼠的DCs混合，并加入IL-2和雷帕霉素(RAPA)培養(yǎng)擴增5天后，收獲細胞并以流式細胞儀檢測擴增的細胞CD25及FOXP3的

3、表達。⑶以C57BL/6小鼠的脾淋巴細胞作為刺激細胞、以CFSE標記的BALB/C小鼠新鮮分離的CD4+CD25T細胞作為增殖效應細胞，共同培養(yǎng)于96孔圓底板進行混合淋巴細胞反應，同時分別加入不同數量的新鮮分離nTregs和不同DC誘導產生的iTregs進行混合淋巴細胞反應，在反應5天后收集細胞以流式細胞儀檢測CD4+CD25-T細胞的增殖效應。比較用CD4CD25免疫磁珠分選試劑盒分選獲得的新鮮分離CD4+CD25+細胞(nTregs

4、)與不同DC誘導產生的CD4+CD25+FOXP3+細胞(iTregs)對效應性T細胞（Teffs）的增殖抑制效應。⑷建立小鼠異基因移植GVHD模型:以C57BL/6(H-2b)雄性小鼠為供鼠、8-10周齡SPF級BALB/c(H-2d)小鼠為受鼠，受鼠接受劑量率0.5 Gy/min、總劑量8.0 Gy的全身照射(TBI)預處理后，以1∶1比例輸入供鼠骨髓單個核細胞及脾淋巴細胞建立小鼠異基因移植GVHD模型。⑸比較不同DC誘導產生和新鮮

5、分離的CD4+CD25+FOXP3+細胞對移植效應的影響:受鼠于移植0天、+1天、+3天和+5經尾靜脈分別輸入新鮮分選的同基因(H-2d)小鼠、異基因(H-2b)小鼠的nTregs和不同DC誘導產生的iTregs治療GVHD，觀察移植受鼠GVHD發(fā)生率、長期存活率、植入及造血重建等移植效應。
　　 結果：①新鮮分選和不同DC誘導產生的CD4+CD25+T細胞FOXP3表達檢測:經流式細胞儀檢測，免疫磁珠法新鮮分選的CD4+CD2

6、5+細胞FOXP3陽性表達率為5％;經BALB/C、C57BL/6和C3H/HeNCrlVr小鼠DCs誘導培養(yǎng)BALB/C小鼠脾CD4+T細胞獲得的CD4+CD25+細胞FOXP3陽性表達率分別為14.7％、12.7％和19.7％;經統(tǒng)計學分析，3種不同基因小鼠DC誘導產生的CD4+CD25+T細胞FOXP3表達均較新鮮分離的CD4+CD25+細胞增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);但3種不同基因小鼠DC誘導產生的CD4+CD25+

7、細胞之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。②不同Tregs對體外混合淋巴細胞反應的抑制試驗:新鮮分離的同基因(H-2d)和異基因(H-2b)小鼠nTregs對淋巴細胞增殖的抑制率差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。異基因(H-2b)小鼠DCs誘導的iTregs對淋巴細胞增殖的抑制率比2種新鮮分離的nTregs明顯增高（P＜0.05）;而同基因(H-2d)和第三方(C3 H/HeNCrlVr)小鼠DCs誘導的iTregs對淋巴細胞增殖的

8、抑制率則比2種新鮮分離的nTregs降低(P＜0.05)。③不同Tregs對小鼠異基因骨髓移植效應的影響:注射骨髓細胞和脾淋巴細胞的小鼠全部移植成功，均出現GVHD的臨床表現如弓背、脫毛、體重下降及肝臟、脾臟、小腸組織GVHD病理學改變。各組受鼠GVHD嚴重程度比較:GVHD組＞allo-nTregs(C57BL/6)組＞allo-iTregs(C3H)組＞auto-nTreg(BALB/C)組＞auto-iTreg(BALB/C)組＞

9、allo-iTregs(C57BL/6)組;各組受鼠移植+60天存活率:GVHD組和allo-nTregs(C57BL/6)組均無存活，auto-nTreg(BALB/C)組及allo-iTregs(C3H)組均為20％，auto-iTreg(BALB/C)及allo-iTregs(C57BL/6)組均為40％。注射Tregs顯著延長GVHD小鼠的存活期(P＜0.05)，注射具有抗原特異性的Tregs的小鼠存活率、嵌合體比例及外周血淋巴

10、細胞CD4+CD25+FOXP3+表達均比注射新鮮分離的nTregs和非抗原特異性Tregs的小鼠高(P＜0.05)，而外周血白細胞計數無明顯變化(P＜0.05)。
　　 結論：⑴不同DC誘導產生的iTregs中FOXP3表達比新鮮分選的nTregs中FOXP3表達高。⑵不同DC誘導產生和新鮮分離的CD4+CD25+FOXP3+細胞均能抑制混合淋巴細胞反應中CD4+CD25-T效應細胞的增殖效應。異基因DCs誘導產生的iTreg