供體抗原特異性Treg細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠胰島移植耐受.pdf

1、第一部分
　　 【目的】探討穩(wěn)定、高效的獲得小鼠胰島細(xì)胞的方法，建立小鼠胰島分離的標(biāo)準(zhǔn)化方案。
　　 【方法】BALB/c小鼠采用膽總管內(nèi)灌注不同濃度膠原酶（0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml）和不同的水浴消化時(shí)間（10min、20min、30min），膨脹消化胰腺的方法分離小鼠胰島，F(xiàn)icoll-400不連續(xù)密度梯度離心法純化胰島。純化出的胰島細(xì)胞在體外采用雙硫腙(Dithizone，DTZ)進(jìn)行特異性染

2、色計(jì)算胰島產(chǎn)量及純度，并進(jìn)行葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)測胰島功能。
　　 【結(jié)果】不同濃度的膠原酶在不同時(shí)間內(nèi)靜止消化胰腺后，收獲的胰島數(shù)量有較大的差別，其中采用0.5mg/ml膠原酶Ⅴ,38℃水浴靜止消化20分鐘組收獲量最大為（190±18）個(gè)胰島細(xì)胞團(tuán)，純度約90％。DTZ染色后胰島呈腥紅色，形態(tài)完整。葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)，胰島素能隨葡萄糖濃度增加而增加，高糖刺激后胰島素釋放量和低糖刺激后分別為0.535±0.175ng/islet和1.26

3、6±0.321ng/islet。
　　 【結(jié)論】小鼠胰島分離的過程中膠原酶的灌注、酶的濃度、消化時(shí)間、消化溫度、小鼠品系、小鼠體重等因素都會(huì)對結(jié)果產(chǎn)生很大影響。但膠原酶濃度、消化時(shí)間和溫度是影響小鼠胰島分離結(jié)果的最重要因素，當(dāng)膠原酶濃度為0.5mg/ml，消化時(shí)間20分鐘時(shí)可獲得數(shù)量較多，純度較好的胰島細(xì)胞。
　　 第二部分
　　 【目的】研究小鼠骨髓來源不成熟樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

4、r>　　 【方法】取Babl/c小鼠的后腿骨髓細(xì)胞，破紅后，體外加入小鼠細(xì)胞因子rmGM-CSF和IL-4共培養(yǎng)，采用的細(xì)胞因子的終濃度分別為rmGM-CSF 20 ng/ml、IL-4 10ng/ml。在含5％ CO2的孵箱中培養(yǎng)48小時(shí)后全量換液去除懸浮細(xì)胞，加入含有同樣濃度細(xì)胞因子的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，第五天半量換液，第七天收獲不貼壁細(xì)胞。將收獲的細(xì)胞用抗小鼠CD11c、MHC-Ⅱ、CD80和CD86流式抗體染色后上流式細(xì)胞儀檢

5、測，分析結(jié)果。
　　 【結(jié)果】鏡下觀察：細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，有很多細(xì)胞開始貼壁生長，第一次全量換液去除懸浮細(xì)胞后，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。培養(yǎng)到第五天，可見細(xì)胞有大量增殖，并有很多集落樣生長的細(xì)胞出現(xiàn)。第七天收獲時(shí)，集落數(shù)量明顯減少，同時(shí)細(xì)胞開始變得疏松，很多細(xì)胞開始懸浮生長，集落里的細(xì)胞數(shù)也明顯沒有第五天的多，高倍鏡下可以看見細(xì)胞周圍有大量毛刺。流式細(xì)胞儀檢測：結(jié)果顯示所得細(xì)胞中高表達(dá)CD11c，中度表達(dá)MHC-Ⅱ、低表達(dá)CD80和

6、CD86，其中CD11c陽性的占80％以上，MHC-Ⅱ陽性的約占40％～50％、CD80和CD86陽性的不到總細(xì)胞數(shù)的10％。說明所得的細(xì)胞中樹突狀細(xì)胞的含量很高，純度超過80％，并且基本為不成熟的樹突狀細(xì)胞。
　　 【結(jié)論】采用濃度分別為20ng/ml的rmGM-CSF和10ng/ml的IL-4和Babl/c小鼠的骨髓細(xì)胞體外共同培養(yǎng)7天的方法可以獲得純度超過80％的樹突狀細(xì)胞，并且基本是不成熟的樹突狀細(xì)胞。
　　 第

7、三部分
　　 【目的】研究小鼠抗原特異性Treg細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法，并鑒定擴(kuò)增出來的細(xì)胞是否具有抗原特異性。
　　 【方法】先用免疫磁珠分選出C57小鼠的脾臟細(xì)胞中的CD4+CD25+T細(xì)胞，然后同Babl/c小鼠的骨髓來源不成熟DC按1:1混合培養(yǎng)，并加入高濃度的小鼠IL-2（2000 U/ml），混合培養(yǎng)7天后收獲細(xì)胞，取一部分細(xì)胞進(jìn)行流式分析，檢測CD4+CD25+Fop3+細(xì)胞的含量。另取一部分進(jìn)行T細(xì)胞增殖抑制

8、試驗(yàn)，試驗(yàn)分兩組：實(shí)驗(yàn)組：采用CFSE染色過的C57小鼠的CD4+T細(xì)胞、MMC處理過的Babl/c小鼠的成熟DC細(xì)胞和擴(kuò)增出的Treg細(xì)胞混合培養(yǎng)；第三方刺激細(xì)胞對照組：采用CFSE染色過的C57小鼠的CD4+T細(xì)胞、MMC處理過的昆明小鼠的成熟DC細(xì)胞和擴(kuò)增出的Treg細(xì)胞混合培養(yǎng)。通過抑制T細(xì)胞增殖能力不同判斷擴(kuò)增出來的Treg細(xì)胞是否有抗原特異性。
　　 【結(jié)果】采用免疫磁珠分選的方法可以分選出純度超過90％的Treg細(xì)

9、胞；使用不成熟DC擴(kuò)增后的細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量明顯增加，可以獲得純度在60％以上的CD4+CD25+Fop3+的Treg細(xì)胞。并且T細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組中擴(kuò)增出的Treg細(xì)胞對T細(xì)胞的抑制能力明顯強(qiáng)于對照組，說明該方法擴(kuò)增出的Treg細(xì)胞具有一定的抗原特異性。
　　 【結(jié)論】供體來源的不成熟DC細(xì)胞在高濃度IL-2存在的情況下，在體外可以大量擴(kuò)增出具有供體抗原特異性的Treg細(xì)胞。
　　 第四部分
　　 【目的】研究

10、體外擴(kuò)增獲得的抗原特異性Treg細(xì)胞能否誘導(dǎo)小鼠胰島移植耐受。
　　 【方法】采用向C57小鼠腹腔內(nèi)一次注射STZ 200mg/kg的方法先制作出糖尿病小鼠。然后建立從BALB/c小鼠到C57小鼠的胰島移植模型，觀察移植后小鼠血糖情況來判斷移植胰島細(xì)胞的存活時(shí)間。實(shí)驗(yàn)分組：共分三組，第一組（不處理對照組）：不給處理，只觀察血糖變化；第二組（單純胰島移植組）：給予胰島移植，不注射Treg細(xì)胞；第三組（實(shí)驗(yàn)組）：術(shù)前1天從靜脈給予1

11、×106個(gè)供者特異性Treg細(xì)胞，然后進(jìn)行胰島移植。
　　 【結(jié)果】15只C57小鼠通過腹腔一次性注射STZ200mg/kg后，按血糖高于16.7mmol/l的標(biāo)準(zhǔn)有12只建模成功，成模率為80％，死亡率為0。胰島移植后，第一組血糖穩(wěn)定，觀測期間無太大變化；第二組血糖術(shù)后1～2天全部恢復(fù)正常，到7～11天時(shí)陸續(xù)開始升高，并維持在術(shù)前水平；第三組血糖術(shù)后1～2天全部恢復(fù)正常，5只分別在第8、19、23、23、31天血糖升高超過16