殺傷性人工抗原提呈細胞靶向殺傷抗原特異性T細胞及抑制皮膚移植排斥的研究.pdf

1、系統(tǒng)性使用大劑量免疫抑制藥物治療移植排斥導致的眾多副作用，促使了針對移植排斥的特異性免疫療法的發(fā)展。選擇性清除或抑制同種反應性T細胞是治療移植排斥的理想策略之一。因此，近十余年來，非細胞性的、以抗原肽/主要組織相容性抗原(peptide/major histocompatibility complex，p/MHC)為靶向的，針對抗原特異性T細胞的特異性殺傷制劑被廣泛研究。最新的進展之一是在非細胞性載體表面包被pMHC多聚體和Fas配體，

2、制備殺傷性人工抗原遞呈細胞(Killer artificial antigen-presenting cells,KaAPCs)。其中以磁珠或膠乳微球為載體的KaAPCs已經(jīng)被報道能在體外選擇性殺傷抗原特異性T細胞。然而，此類載體不易在體內生物降解，缺乏生物相容性，且在體內和器官移植模型中的研究鮮有報道。
　　本研究是以可生物降解的聚乳酸-羥基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)微球(Mic

3、roparticles，MPs)作為載體，在其表面共包被H-2Kb-Ig二聚體和anti-Fas單抗，制備成基于PLGA的KaAPCs。其表面的H-2Kb-Ig二聚體可以裝載特定的抗原肽，形成p/MHC復合體，從而與抗原特異性T細胞的TCR靶向結合，同時其表面的anti-Fas單抗能夠誘導抗原特異性T細胞凋亡，達到靶向殺傷抗原特異性T細胞的目的。在同種異體移植模型中，KaAPCs表面的H-2Kb-Ig二聚體即作為同種抗原，與受者鼠體內H

4、-2Kb同種抗原反應性CD8+T細胞的TCR特異性結合，并利用anti-Fas單抗誘導活化的同種反應性T細胞凋亡，實現(xiàn)對移植排斥的特異性免疫治療。
　　目的:
　　以OT-1轉基因小鼠為模型研究KaAPCs能否在體外和其體內選擇性清除OVA257-264抗原特異性T細胞;并以小鼠同種異體皮膚移植為模型，分析KaAPCs特異性殺傷同種反應性T細胞的能力和治療移植排斥的效果，進而探討其在體內的作用機制。
　　方法及結果:<

5、br>　　1、PLGA MPs的制備及表征:以PLGA聚合物為原材料，采用乳化溶劑揮發(fā)法制備直徑約為5μm的PLGA MPs，并利用化學修飾法使其表面功能化（帶有NH2+）;通過掃描電鏡(Scanning Electronic Microscopy，SEM)、粒徑分析儀和Zeta電位分析儀對PLGA MPs進行表征，并通過蛋白定量和流式技術分析其吸附蛋白的能力。結果顯示:PLGA MPs在SEM下呈現(xiàn)良好的球形，粒徑分布在1-10μm，

6、且80％的MPs集中在5-6μm，平均Zeta電位為65.2士6.7 mV，表明其帶有足夠電荷，2×107MPs對BSA的最大吸附量為80μg。以上結果表明自制的PLGA MPs具有良好的表征。
　　2、KaAPCs的制備及其表型分析:把PLGA MPs和H-2Kb-Ig二聚體以及anti-Fas單抗共孵育后，制備成KaAPCs，并經(jīng)特異性熒光單抗染色、流式細胞技術和激光共聚焦技術驗證KaAPCs表型。結果顯示，H-2Kb-Ig二

7、聚體和anti-Fas單抗被成功共包被到PLGA MPs表面，表明所制的KaAPCs具有良好的表型。
　　3、KaAPCs靶向殺傷OVA257-264抗原特異性T細胞:在體外，把裝載OVA257-264的KaAPCs(Kb/OVA-KaAPC)與OT-1轉基因小鼠（其CD8+T細胞TCR以H-2Kb限制的方式識別OVA257-264）的脾細胞共孵育24小時，通過流式細胞術檢測T細胞群中CD8+T細胞的凋亡比例以及OVA257-26

8、4特異性CD8+T細胞的數(shù)量比例。結果顯示:Kb/OVA-KaAPC能夠誘導大約80％的CD8+T細胞凋亡，OVA257-264特異性CD8+T細胞比例顯著下降83％左右。而無關抗原肽對照組沒有出現(xiàn)明顯凋亡，OVA257-264特異性CD8+T細胞沒有明顯減少，表明KaAPCs能夠在體外特異性地殺傷抗原特異性CD8+T細胞。其中anti-Fas介導的凋亡為主，活化誘導的凋亡(AlCD)極少。在體內，Kb/OVA-KaAPC經(jīng)尾靜脈注入O

9、T-1鼠后，在不同時間點通過流式細胞術分析其外周血中CD8+T細胞的凋亡比例及OVA257-264特異性CD8+T細胞的數(shù)量比例。結果與體外實驗相似，CD8+T細胞凋亡比例最高達75％左右，OVA257-264特異性CD8+T細胞的比例最高下降大約84％，而對照組無顯著變化。KaAPC的殺傷效率與其劑量、作用時間呈正相關。這表明KaAPC在體內也能靶向殺傷抗原特異性的CD8+T細胞。
　　4、KaAPC抑制小鼠皮膚移植排斥的有效方

10、案的研究:以C57BL/6鼠(H-2Kb)和BALB/c鼠(H-2Kd)為供受體，建立同種異體皮膚移植模型。KaAPCs（包被自制H-2Kb單體和商品化anti-Fas單抗）經(jīng)尾靜脈或局部注入受者鼠后，觀察移植皮塊的生存狀況，進行臨床評分，并通過免疫熒光染色檢測移植皮塊中CD8+T和CD4+T細胞的浸潤量，同時多指標監(jiān)測受者鼠的整體免疫功能。結果:比較多種方案的效果后，明確了靶向抗原和anti-Fas的包被劑量、KaAPCs的注射途徑、

11、劑量、次數(shù)和時間點等治療措施。據(jù)此，KaAPCs能顯著延長移植皮塊的生存時間達4-6天，并明顯減少移植皮塊中CD8+T細胞的浸潤數(shù)量，對CD4+T細胞無明顯影響，且不明顯抑制受者鼠的整體免疫功能。
　　5、KaAPC抑制小鼠皮膚移植排斥的優(yōu)化方案及其機制研究:以C57BL/6鼠(H-2Kb)和bm1鼠（H-2Kbm1）為供受體，建立同種異體皮膚移植模型。在優(yōu)化方案下，經(jīng)三次尾靜脈注射KaAPCs（包被商品化H-2Kb-Ig二聚體和

12、商品化anti-Fas）治療受者鼠后，觀察移植皮塊的生存狀況和排斥程度;流式細胞術檢測受者鼠外周血和脾臟中T細胞的凋亡比例及H-2Kb同種反應性CD8+T細胞比例;免疫組化分析移植皮塊中浸潤的CD8+T、CD4+T細胞和H-2Kb同種反應性T細胞的量;針對供體的同種增殖能力檢測;脾臟及淋巴結中調節(jié)性T細胞的檢測;KaAPCs對受者鼠脾臟中B、NK、T細胞以及外周血中單核細胞、中性粒細胞和淋巴細胞群等的影響;通過抗腫瘤能力、T細胞庫針對第

13、三方抗原的同種增殖能力和NK細胞殺瘤能力的分析，監(jiān)測KaAPCs對受者鼠整體免疫功能的影響;觀察KaAPCs在體內的運行和分布。結果顯示:三次尾靜脈輸注后KaAPCs能經(jīng)血流進入淋巴結和脾臟，并與CD8+T細胞直接接觸，有效地靶向殺傷外周血和脾臟中同種反應性CD8+T細胞，殺傷率達82％左右，從而大幅減少了同種反應性CD8+T細胞在移植皮塊中的浸潤，同時上調了淋巴結中調節(jié)性T細胞的水平，最終延長移植皮塊的存活時間達42.5天，且對受者鼠