EPCAM抗原負載DC誘導腺癌特異性免疫殺傷的實驗研究.pdf

1、目的:細胞免疫治療作為一種新的腫瘤治療方法，已成為繼手術、化療、放療后的第四大腫瘤治療方法。過繼性細胞免疫治療即應用患者的自身的免疫細胞，通過體外培養(yǎng)、擴增后，繼而再回輸給患者，對自體腫瘤進行特異性殺傷，是一種全身性的腫瘤治療方法，具有副作用小，殺傷效率高，對靜止期細胞及腫瘤干細胞都有殺傷功能，且可產生長久免役記憶。臨床上應用的免疫細胞主要是細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)及全抗原負載的混合免疫細胞，但還不能達到對腫瘤殺傷更高的期望，本

2、實驗通過特異性抗原EPCAM負載樹突狀細胞(DC)誘導混合免疫細胞（EP-effector）與CIK及腫瘤全抗原負載DC誘導混合免疫細胞（Co-effeetor）對腺癌特異性免疫殺傷的對比研究，來證實特異性抗原EPCAM負載DC誘導腺癌特異性免疫殺傷效率是否更高？
　　方法:1體外培養(yǎng)兩種腺癌細胞株，流式細胞儀檢測Colo205、LS-174腺癌細胞株表面EPCAM表達;2通過梯度密度離心法分離健康成人外周血，收集單個核細胞(PB

3、MCs)，采用貼壁法分離出淋巴細胞及imDCs。并且體外誘導淋巴細胞中T細胞轉化為CIK細胞并擴增;3 Colo205裂解物的制備，分別將Colo205裂解物及特異性抗原EPCAM在第5天加入DC細胞中，負載imDCs，促進其成熟，制備成成Colo205細胞裂解物成熟DC(Co-mDCs)及特異性抗原EPCAM成熟DC(EP-mDCs)，流式細胞儀檢測DC細胞在加入抗原前后其免疫表型變化并進行統(tǒng)計學分。4Co-mDCs與EP-mDCs與

4、CIK細胞體外共培養(yǎng)，第7天將兩種DC分別與CIK共培養(yǎng)，通過DC細胞CIK可獲得腫瘤全抗原及特異性抗原EPCAM的相關信息，使得部分CIK細胞轉化成具有特異性殺傷活性的CTL，從而制備成DC-CIK-CTL混合免疫細胞Co-effector及EP-effector。5培養(yǎng)對數期腺癌細胞Colo205，按104/孔分別將100μl Colo205腺癌細胞加入96孔板中，按效靶比E∶T∶5∶1、10∶1、20∶1分別加入CIK、Co-ef

5、fector及EP-effector與腫瘤細胞共培養(yǎng)，同時設單一靶細胞組、單一效應細胞組及空白對照組，每實驗組各設3個復孔。37℃，5％ CO2保濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時后，加入CCK-820ul/孔，培養(yǎng)箱中孵育4小時后，用酶標儀在450nm波長測定各組吸A值。根據公式殺傷率(％)=1-(實驗組A值-單純效應細胞組A值）/單純靶細胞A值×100％，計算出效應細胞對腫瘤細胞的殺傷率，進行統(tǒng)計學分析。
　　結果:
　　1 Col

6、o205及LS174-T細胞EPCAM抗原表達量分別為99.73％、99.61％。
　　2 DC細胞在培養(yǎng)第5天，流式細胞儀檢測細胞表面CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表達水平分別為11.9％、16.1、16.1％、28.1％，呈現(xiàn)相對低水平，提示DC細胞處于未成熟狀態(tài)，具有較強的遷移能力及攝取能力;于第5天分別加入腫瘤全抗原及EPCAM抗原培養(yǎng)至第7天，細胞表面CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表達水平分別

7、為41.1％、66.3％、79.3％、83％及41.7％、69.6％、78.9％、85.7％，與未成熟DC細胞表面分子表達有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); DC細胞在加入抗原前后細胞表面分子從低表達到高表達，說明DC細胞已經成熟，具有抗原提呈能力。
　　3 CIK、Co-effector及EP-effector均可以殺傷腫瘤細胞，在效靶比E∶T分別為5∶1、10∶1、20∶1時，CIK效應細胞的殺傷率(％)分別為:40.54±2.7

8、1、49.27±3.57、67.04±5.20; Co-effector效應細胞的殺傷率(％)分別為:54.13±3.83、66.40±4.58、75.65±5.37; EP-effector效應細胞的殺傷率(％)分別為:60.51±4.54、75.17±6.10、92.53±8.87。在組內三者隨著效靶比的增加，殺傷率逐漸增大;在效靶比靶比E∶T20∶1條件下，CIK殺傷率比Co-effector、EP-effector低，相互之間有