尤文肉瘤細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染DC體外誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL殺傷作用的研究.pdf

1、尤文肉瘤是兒童常見(jiàn)原發(fā)惡性骨腫瘤，惡性程度高，進(jìn)展快，死亡率高，盡管放療化療使尤文肉瘤患者的5年生存率有了很大提高，但仍有半數(shù)病人死于全身轉(zhuǎn)移。人類(lèi)腫瘤抗原以及腫瘤抗原基因的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)，為腫瘤的免疫治療尤其是主動(dòng)性免疫治療提供了新的手段。直接作用于腫瘤特異性抗原或相關(guān)抗原的瘤苗是目前研究的熱點(diǎn)。95％的尤文肉瘤家族具有特異的染色體異位t(11；22)(q24；q12)，從而形成的EWS-FLI1融合基因是尤文肉瘤家族發(fā)生、進(jìn)展的主要原因

2、，也是尤文肉瘤家族診斷、治療及預(yù)后的標(biāo)志物。因此，制備特異性瘤苗，誘導(dǎo)針對(duì)EWS-FLI1的特異性免疫反應(yīng)，可作為尤文肉瘤治療的一種新思路。樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)是體內(nèi)功能強(qiáng)大的專(zhuān)職性抗原提呈細(xì)胞，它能夠高效地?cái)z取、處理抗原，并將處理后的多肽呈遞給靜息型T細(xì)胞，引起針對(duì)該抗原的特異性免疫反應(yīng)。DC應(yīng)用于腫瘤免疫治療是目前的研究熱點(diǎn)。許多研究證實(shí)，腫瘤患者樹(shù)突狀細(xì)胞的質(zhì)量及功能均減弱，MHC分子和共刺激分子CD

3、80，CD86的表達(dá)量下降，體外誘導(dǎo)功能正常的樹(shù)突狀細(xì)胞，經(jīng)腫瘤相關(guān)性抗原或特異性抗原修飾，作為疫苗免疫腫瘤患者，是腫瘤治療的一個(gè)發(fā)展方向。制備DC瘤苗的方法有腫瘤特異性抗原、腫瘤相關(guān)性抗原、腫瘤細(xì)胞裂解物與DC共培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染DC，腫瘤細(xì)胞與DC融合、腫瘤特異性或相關(guān)性抗原基因轉(zhuǎn)染DC；腫瘤細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染制備DC瘤苗是目前常用的方法。 目的：充分利用人體外周血來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC

4、)強(qiáng)大的抗原提呈能力和激活T細(xì)胞尤其是初始型T細(xì)胞的能力，用尤文肉瘤細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染DC制成一種治療性疫苗，觀察這種疫苗體外誘導(dǎo)腫瘤患者特異性抗瘤免疫的能力。尋找新的治療尤文肉瘤的途徑，并初步探討尤文肉瘤相關(guān)性抗原EWS-FLI1作為尤文肉瘤靶向治療的可行性。 方法：采集尤文肉瘤患者外周白細(xì)胞富集血，分離單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。貼壁的單核細(xì)胞在完全培養(yǎng)基加rhGM-CSF, rhIL-4及MCM的培養(yǎng)條件中培養(yǎng)8天獲得成熟DC，光學(xué)

5、顯微鏡下觀察DC的形態(tài)，流式細(xì)胞儀確認(rèn)成熟DC的表面標(biāo)志。從尤文肉瘤細(xì)胞中提取總RNA，并通過(guò)RT-PCR結(jié)果來(lái)鑒定總RNA中EWS-FLI1融合基因的存在?；旌狭馨图?xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MLR)比較轉(zhuǎn)染前后的DC刺激淋巴細(xì)胞增殖功能的差別。MTT法測(cè)定CTL的殺傷活性，殺傷實(shí)驗(yàn)中的效應(yīng)細(xì)胞使用尤文肉瘤細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染的DC(RNA-DC)，未經(jīng)尤文肉瘤細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染的DC(DC)分別與淋巴細(xì)胞按20∶1和40∶1比例混合接種于24孔板，第2

6、天加入IL-2，繼續(xù)培養(yǎng)4天。收集的兩組淋巴細(xì)胞(CTL)作為效應(yīng)細(xì)胞，未誘導(dǎo)單純淋巴細(xì)胞為對(duì)照。靶細(xì)胞用人尤文肉瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞以及宮頸癌細(xì)胞。以MTT法檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率，比較三組效應(yīng)細(xì)胞對(duì)三種靶細(xì)胞的殺傷作用，比較特異性殺傷和非特異性殺傷的差別。臨床制備尤文肉瘤細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染的DC疫苗并對(duì)疫苗進(jìn)行活性檢測(cè)，對(duì)尤文肉瘤術(shù)后患者予以注射，近期臨床觀察主要為：疫苗注射患者短期內(nèi)有無(wú)因疫苗注射引起的免疫反應(yīng)，及毒副作用包括發(fā)

7、熱、感染、局部皮膚破潰等。遠(yuǎn)期臨床觀察主要重點(diǎn)為無(wú)腫瘤生存期。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。 結(jié)果：應(yīng)用GM-CSF,IL-4作用于外周血單個(gè)核細(xì)胞，成功地誘導(dǎo)出DC，患者DC誘導(dǎo)后顯示出典型樹(shù)突狀細(xì)胞形態(tài)及表型特征。倒置顯微鏡下細(xì)胞周?chē)梢?jiàn)毛刺狀突起和樹(shù)枝狀突起；誘導(dǎo)7天經(jīng)MCM活化成熟后，DC細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)明顯升高，分別為：CDla(60.19％)、CD83(84.75％)、CD86(59.65％)、

8、HLA-DR(82.22％)，為典型DC。總RNA加載樹(shù)突狀細(xì)胞的RT-PCR測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，尤文肉瘤中的特異性序列EWS-FLI1可以和引物特異性結(jié)合，并且最佳結(jié)合溫度為54℃。提取的尤文肉瘤總RNA經(jīng)電泳鑒定，準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)染到DC中，可以特異性表達(dá)尤文肉瘤的特異性序列EWS-FLI1。混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果顯示，患者成熟DC具有高效刺激自體淋巴細(xì)胞的能力，其刺激指數(shù)(SI)與IDC和PBMC比較有顯著差異(P＜0.05)。RNA-DC刺激前后

9、淋巴細(xì)胞成分比例發(fā)生變化，CD4+占(46.5±2.96)％，比例下降不明顯(p＞0.05)；CD8+(CTL)比例上升(p＜0.05)，達(dá)到(45.1±7.87)％。CD8+T細(xì)胞所占比例升高說(shuō)明RNA-DC誘導(dǎo)自體T細(xì)胞向CTL方向增殖分化，CTL的增殖是該疫苗引發(fā)特異性抗瘤免疫的基礎(chǔ)。DC誘導(dǎo)CTL特異性殺傷效應(yīng)時(shí)，不同效靶比均顯示RNA-DC組誘導(dǎo)的CTL對(duì)尤文肉瘤細(xì)胞具有高效特異的殺傷活性，殺傷率分別為42.6±1.97(E∶

10、T為25∶1)、56.8±2.76(50∶1)、72.7±2.18(100∶1)，顯著高于單純DC組和單純淋巴細(xì)胞組(P＜0.05)；同一效靶比時(shí)(20∶1和40∶1)，RNA-DC組對(duì)尤文肉瘤細(xì)胞的殺傷率明顯高于乳腺癌細(xì)胞MCF-7和宮頸癌細(xì)胞Hela的殺傷率(P＜0.05)，且三組效應(yīng)細(xì)胞對(duì)MCF-7和Hela的殺傷率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。臨床應(yīng)用的初步報(bào)告顯示疫苗注射患者腫瘤無(wú)局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，病人一般狀況良好，自覺(jué)全身

11、免疫功能增強(qiáng)。無(wú)與治療目的無(wú)關(guān)的各種副反應(yīng)，患者未出現(xiàn)感染，注射部位無(wú)紅斑、潰爛等表現(xiàn)。 結(jié)論：應(yīng)用GM-CSF,IL-4作用于外周血單個(gè)核細(xì)胞，成功地誘導(dǎo)出DC。尤文肉瘤細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染未成熟DC，轉(zhuǎn)染后的DC可表達(dá)EWS-FLI1，并能夠誘導(dǎo)出對(duì)EWS-FLI1具有特異性殺傷作用的CTL。目前，腫瘤抗原特別是純化的腫瘤抗原獲取比較困難，本研究應(yīng)用總RNA轉(zhuǎn)染取代腫瘤抗原致敏DC，可以很好地解決這一問(wèn)題。總RNA包含多種抗原和

12、某一蛋白的多個(gè)表位，可被不同型HLA遞呈。以總RNA沖擊DC,不需要預(yù)先了解患者的HLA表型，這為其在臨床上的應(yīng)用打開(kāi)廣闊的適用空間。大多尤文肉瘤患者具有EWS-FLI1融合基因，應(yīng)用尤文肉瘤總RNA轉(zhuǎn)染DC制備的DC疫苗對(duì)表達(dá)EWS-FLI1的尤文肉瘤細(xì)胞有強(qiáng)的殺傷作用，EWS-FLI1作為靶向位點(diǎn)在治療尤文肉瘤方面具有可行性。本研究證實(shí)，RNA-DC疫苗可以作為尤文肉瘤的一種免疫治療手段，為DC瘤苗的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。應(yīng)用尤文肉瘤