rAAV轉(zhuǎn)染DC誘導(dǎo)的CTL對肝癌細胞的體外殺傷效應(yīng)及機制探討.pdf

1、目的：
　　通過比較攜帶AFP、CEA、AFP和CEA抗原基因的重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）載體轉(zhuǎn)染樹突狀細胞（dendritic cell，DC）誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）體外對肝癌細胞及正常細胞的殺傷效果，同時觀察DC誘導(dǎo)CTL過程中DC和T細胞的形態(tài)學(xué)變化，檢測DC、T細胞表面分子及T細胞IFN-γ的

2、表達率，初步探討rAAV轉(zhuǎn)染DC誘導(dǎo)的CTL對肝癌細胞的體外殺傷效應(yīng)及機制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法：
　　采集、分離健康人外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC）用于制備DC及CTL。DC由細胞因子GM-CSF、IL-4、TNF-α及攜帶腫瘤抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體rAAV-AFP、rAAV-CEA、（rAAV-AFP+rAAV-CEA）分別刺激分化成熟，

3、成熟DC與淋巴細胞混合誘導(dǎo)CTL產(chǎn)生。DC誘導(dǎo)CTL過程中DC和T細胞的形態(tài)學(xué)變化采用顯微鏡觀察并拍照記錄，DC表面分子CD80、CD83、CD86和T細胞表面分子CD4、CD8、CD25、CD69及IFN-γ的表達率采用流式細胞儀檢測。MTS法檢測rAAV-AFP、rAAV-CEA、（rAAV-AFP+rAAV-CEA）轉(zhuǎn)染DC及未經(jīng)病毒載體轉(zhuǎn)染DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL體外對HepG2細胞及正常細胞的殺傷率，同時與加入抗人主要組織相容性復(fù)

4、合體（major histocompatibility complex，MHC）I型單抗的CTL對HepG2細胞的殺傷率進行比較，探討CTL殺傷作用的MHC限制性。
　　結(jié)果：
　　觀察DC培養(yǎng)過程，DC體積逐漸增大，樹突增多，逐漸分化、成熟，至第6天時，其表面CD80、CD83、CD86的表達率分別為42％、49%、81%；DC及淋巴細胞混合后，可見明顯的成團趨勢，培養(yǎng)第14天的T細胞表面CD4、CD25、CD8、CD69

5、表達率分別為49%、5%、43%、33%，且可被刺激分泌IFN-γ。rAAV-AFP、rAAV-CEA、（rAAV-AFP+rAAV-CEA）轉(zhuǎn)染DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL均能殺傷HepG2細胞，而對不表達相應(yīng)腫瘤抗原的正常細胞無明顯殺傷作用，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；rAAV-AFP-DC-CTL與rAAV-CEA-DC-CTL對HepG2細胞的殺傷率分別為43%、34%，兩者間無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.21）；（rAAV-AFP+r

6、AAV-CEA）-DC-CTL對HepG2細胞的殺傷率更高，為53%，與rAAV-CEA-DC-CTL對比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.02），而與rAAV-AFP-DC-CTL對比無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.26）。未經(jīng)rAAV轉(zhuǎn)染DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL對腫瘤細胞也有殺傷作用，但顯著小于 rAAV-DC-CTL（P<0.05）。加入抗 MHCⅠ型單抗的rAAV-DC-CTL對HepG2細胞的殺傷率明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。