α-GalCer負(fù)載DC激活CIK細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)研究.pdf

1、樹突狀細(xì)胞是迄今體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，在免疫應(yīng)答誘導(dǎo)中有獨(dú)特的地位。CIK細(xì)胞是新型的免疫活性細(xì)胞，是由多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的殺傷細(xì)胞，具有T細(xì)胞的抗瘤活性和MHC限制性殺瘤的特點(diǎn)。CIK細(xì)胞和DC細(xì)胞是目前應(yīng)用較多的過繼免疫治療的有效方法。α-半乳糖神經(jīng)酰胺在臨床試驗(yàn)中作為一種抗癌劑，對很多實(shí)體腫瘤均有效。腫瘤的臨床實(shí)驗(yàn)表明，注射α-GalCer負(fù)載的DC比單獨(dú)注射α-GalCer呈現(xiàn)出更大的抗腫瘤活性。但荷載α-GalCer

2、的成熟DC對CIK細(xì)胞的功能活化還尚未見研究。本研究在以往研究的基礎(chǔ)上，探索α-GalCer負(fù)載DC對CIK細(xì)胞的激活作用及殺傷活性的影響，為DC-CIK在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。
　　目的:
　　探討α-GalCer負(fù)載對人外周血樹突狀細(xì)胞(DC)的激活作用及功能的影響;研究負(fù)載α-GalCer的DC能否在體外激活乙肝患者外周血中的NKT細(xì)胞;探討α-GalCer-DC與CIK共培養(yǎng)對CIK細(xì)胞表型、增殖活性及殺傷肝

3、癌細(xì)胞效率的影響。
　　方法:
　?。ㄒ唬┎捎妹芏忍荻入x心法從人外周血中分離出單個(gè)核細(xì)胞，懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞，貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)DC細(xì)胞，在光鏡下觀察其形態(tài)和生物學(xué)特征;流式細(xì)胞儀檢測DC與CIK細(xì)胞的免疫表型。（二）流式細(xì)胞儀檢測α-GalCer負(fù)載的DC細(xì)胞表型，qRT-PCR檢測DC細(xì)胞相關(guān)基因的mRNA水平。（三）采用DC和α-GalCer來誘導(dǎo)培養(yǎng)患者外周血NKT細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測NKT的免疫表型和細(xì)胞因子

4、的表達(dá)水平。（四）將α-GalCer-DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測DC與各組CIK細(xì)胞表面標(biāo)志物;臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測各組CIK細(xì)胞的增殖倍數(shù);qRT-PCR檢測CIK細(xì)胞功能相關(guān)基因的表達(dá)情況;CCK-8試劑盒檢測α-GalCer-DC對CIK細(xì)胞殺傷HepG2的影響。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)過多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)，可獲得CIK細(xì)胞和成熟的DC細(xì)胞。CIK細(xì)胞高表達(dá)CD3+CD8+和CD3+CD56+，成熟DC細(xì)胞高

5、表達(dá)CD86，CD80，CD83和CD11c，低表達(dá)CD14。
　　2.α-GalCer負(fù)載可促進(jìn)DC細(xì)胞成熟，細(xì)胞表面標(biāo)志物CD80，CD86，CD83，CD11c的陽性率均升高，表面趨化因子受體CCR-7、IL-12、IL-10的mRNA水平升高。
　　3.DC和α-GalCer聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)患者外周血NKT細(xì)胞，可以獲得高表達(dá)TCRVα24TCRVβ11的雙陽性NKT細(xì)胞，并使NKT分泌高水平的IL-4和INF-γ。

6、r>　　4.α-GalCer-DC與CIK共培養(yǎng)，可顯著提高CIK細(xì)胞CD3+CD56+的表達(dá)和增殖活性;可顯著提高INF-γ、IL-12、穿孔素和顆粒酶素B的mRNA表達(dá)水平。CCK-8法檢測各組CIK細(xì)胞的殺傷活性，在同一效靶比時(shí)，α-GalCer-DC-CIK細(xì)胞組對靶細(xì)胞的殺傷作用最強(qiáng)，明顯高于CIK、DC-CIK細(xì)胞組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。CCK-8法檢測結(jié)果顯示:CIK細(xì)胞對肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞有明顯的細(xì)胞