抗原致敏DC聯(lián)合CIK細胞對肺癌細胞殺傷作用的研究.pdf

1、腫瘤患者的外周血中存在癌細胞是引發(fā)腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移、導致患者死亡的重要原因.有效清除血循環(huán)中的微量癌細胞對預防腫瘤復發(fā)、改善腫瘤晚期患者的生存質(zhì)量具有重要意義.而體內(nèi)回輸免疫活性細胞的過繼免疫療法可以在不損傷機體免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的前提下,直接殺傷腫瘤細胞,已成為腫瘤手術、放療、化療的重要輔助治療方法. 細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killer,CIK)是由IFN-r、CD3單抗及IL-2等細胞因子在體外刺激外

2、周血單個核細胞而誘生出的具有非特異性細胞毒作用的效應細胞.在現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的所有免疫效應細胞中,具有較強的增殖能力、較強的細胞毒活性和非MHC限制性.而樹突狀細胞(dendritic cell,DC)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原遞呈細胞,可有效激發(fā)免疫應答.因此將CIK細胞和DC細胞聯(lián)合應用治療惡性腫瘤,無疑會起到協(xié)同作用.本實驗通過抗原致敏DC聯(lián)合CIK對肺癌細胞株A549和肺腺癌原代細胞的殺傷作用研究提供理論及試驗依據(jù).目的研究腫瘤抗原致敏

3、的樹突狀細胞(DC)聯(lián)合細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)對肺癌細胞株A549和肺腺癌原代細胞的殺傷作用,并與DC聯(lián)合淋巴因子激活的殺傷細胞(lyInphokine-activated killer,LAK)、CIK、LAK的殺傷效果進行比較.為臨床DC聯(lián)合CIK治療肺癌提供理論和試驗依據(jù). 方法 在無菌條件下取健康獻血者外周新鮮血,采用Ficoll密度梯度離心法分離出單個核細胞(PBMNC),常規(guī)誘導出.DC、CIK、L

4、AK細胞:用肺癌A549細胞提取的腫瘤抗原沖擊DC,倒置顯微鏡下觀察DC形態(tài),流式細胞儀檢測DC經(jīng)抗原沖擊和未經(jīng)腫瘤抗原沖擊后其表型變化;把CIK細胞、DC-CIK細胞、LAK細胞和.DC-LAK細胞作為效應細胞,肺癌細胞株A549和肺腺癌原代細胞作為靶細胞,共分為8組,在10:1、20:1、50:11的效靶比時,進行殺傷試驗;使用LDH釋放法測定殺傷活性;ELISA法檢測殺傷試驗中細胞因子IL-2、IL-4、IL-12、IFN-r的分

5、泌水平. 結(jié)果 一、細胞形態(tài)與增殖觀察:從外周血分離出單個核細胞,貼壁培養(yǎng)2小時,貼壁的細胞用于誘導生成DC,培養(yǎng)8天倒置顯微鏡下可見部分細胞變大、不規(guī)則,伸出偽足,而用肺癌腫瘤抗原沖擊后24h大部分細胞出現(xiàn)毛刺狀突起呈典型樹突狀細胞.懸浮的細胞分別用于誘導生成CIK和LAK細胞,3天后CIK細胞生長迅速,出現(xiàn)大量的生長集落,體積明顯變大呈多形性.而L,AK細胞形態(tài)單一,無明顯集落形成.CIK細胞的增殖能力明顯高于同條件

6、下培養(yǎng)的LAK細胞. 二、DC表型分析:流式細胞儀檢測DC經(jīng)腫瘤抗原沖擊和未經(jīng)腫瘤抗原沖擊其表面分子表達情況,未經(jīng)腫瘤抗原沖擊的DC其表面分子CD40、CD80、CD86、 HLA.DR表達分別為:4.25﹪、12.12﹪、5.16﹪、38.02﹪;經(jīng)腫瘤抗原沖擊后的DC其表面分子CD40、CD80、CD86和HLA-DR表達分別為74.31﹪、85.81﹪、53.29﹪、90.71﹪,差異顯著(P<0.01),這說明經(jīng)腫瘤抗原

7、沖擊后DC細胞明顯成熟. 三、細胞殺傷試驗:在10:1、20:1、50:1三種效靶比時,用LDH釋放法測定DC-CIK細胞、DC-LAK細胞和CIK、LAK細胞對肺癌細胞株A549和肺腺癌原代細胞的殺傷活性.結(jié)果顯示:1、在同一效靶比時,DC-CIK細胞組對靶細胞的殺傷作用最強,明顯高于CIK、DC-LAK、LAK細胞組(P<0.05).2、在效靶比例為10:1～50:1的范圍內(nèi),DC.CIK細胞組殺傷活性隨著效靶比提高而明顯升

8、高,以效靶比為50:1時,殺傷活性最強(P<0.05).3、在同一效靶比時,DC-CIK細胞組對肺癌細胞株A549和肺腺癌原代細胞的殺傷作用無明顯差異(P>0.05). 四、細胞殺傷試驗中細胞因子分泌水平:在效靶比為50:1時,檢測8組細胞殺傷試驗中細胞因子IL-2、IL-4、IL-12、IFN-r量的變化.在同一靶細胞條件下,DC-CIK細胞組中IFN-r、IL-12的含量明顯高于其它3組(P<0.05);而IL-2的含量以D

9、C-LAK細胞組為最高,DC-LAK和LAK細胞組明顯高于其他2組(P<0.05);在8組細胞殺傷試驗中,都沒有檢測到IL-4. 結(jié)論 肺癌抗原致敏的DC聯(lián)合CIK細胞能顯著提高對肺癌細胞的殺傷作用.DC.CIK細胞對肺癌的殺傷作用明顯高于CIK、DC-LAK、LAK細胞.這可能由于腫瘤抗原致敏的DC通過分泌一些細胞因子和共刺激分子來誘導特異性CIK細胞及促進CIK細胞增殖,通過這兩方面來顯著提高CIK細胞的殺瘤效應.D