抗原負載的DC與CIK共培養(yǎng)后對MGC-803胃癌細胞株殺傷活性的研究.pdf

1、目的：胃癌是對人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤之一，目前胃癌臨床治療手段主要是根治性切除手術輔以術前、術后化療及放射治療。由于臨床所見病例多為中晚期患者，手術及放、化療效果差，長期生存率較低，因此，如何提高胃癌根治術后效果，改善胃癌晚期患者生活質量，預防胃癌復發(fā)及轉移一直是臨床長期探索的問題。 腫瘤過繼性細胞免疫治療(adoptive cellular immunotherapy,ACI)是繼手術、化療和放療之后的第四種腫瘤治療

2、模式。迄今，NK細胞、CTL、Mφ、TIL、LAK、CIK和DC細胞的過繼治療已在臨床上得到應用，其中CIK和DC細胞為基礎的抗腫瘤免疫治療以其獨特的優(yōu)勢，近年來成為國內外眾多學者的研究熱點。 細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells,CIK)是由多種細胞因子如IL-2、IFN-γ和CD3單克隆抗體等誘導而成的對多種腫瘤具有殺傷活性的細胞毒性T細胞，其溶瘤活性具有非MHC限制性，是一種非

3、特異性的免疫殺傷細胞。CIK細胞能分泌多種細胞因子(如IL-4、IFN-γ等)，且具有比LAK、CD3AK細胞更強的殺傷活性。樹突狀細胞(dendritic cells,DC)是功能強大的主要的抗原遞呈細胞，分布于除腦和睪丸以外身體各部的任何組織，DC借助膜表面不同受體可有效捕獲低濃度抗原，并能與這些抗原表面的MHC Ⅰ類和Ⅱ類分子結合，刺激初始型CD8+T細胞和CD4+T細胞活化。綜合國內外研究表明，將負載腫瘤抗原的DC細胞和具有高效

4、殺傷活性的CIK細胞聯(lián)合應用治療惡性腫瘤，將有望起到協(xié)同作用。本研究將利用MTT法和流式細胞儀分別完成負載抗原的DC和CIK的聯(lián)合培養(yǎng)物對MGC-803的殺傷活性和凋亡機制的初步研究，為DC和CIK聯(lián)合治療胃癌應用于臨床打下科研基礎。 材料與方法： 1、PBMC來源的CIK和DC細胞制備：提取人外周血單個核細胞(PBMC)，在體外以基因重組人白介素-2 (interleukine-2,IL-2)、鼠抗人CD3單抗(ant

5、i-CD3McAb)、基因重組人白介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)、基因重組人干擾素-γ(interferon-γ，INF-γ)等細胞因子刺激非貼壁細胞獲得成熟CIK；以基因重組人粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage CSF,GM-CSF)和基因重組人白介素-4(interleukine-4,IL-4)刺激貼壁細胞獲得DC，并以流式細胞儀檢測細胞表型。 2、MGC-80

6、3胃癌細胞可溶性抗原制備及定量：以液氮反復凍融MGC-803細胞，過濾，制成用以刺激DC細胞的可溶性抗原，以考馬斯亮藍法對蛋白抗原進行定量測定。 3、不同效靶比和培養(yǎng)天數下，不同效應細胞組殺傷功能的比較：將效應細胞分作3組：單純CIK組、未負載MGC-803抗原的DC+CIK組和負載MGC-803抗原的DC+CIK組，分別記做：CIK、DC-CIK和Ag-DC-CIK。效應細胞培養(yǎng)12d后，以MTT法測定CIK、DC-CIK和A

7、g-DC-CIK對MGC-803殺傷作用，效靶比分別為：2.5:1、5:1、10:1、20:1，并測定不同時間對其作用的影響。 4、酶聯(lián)免疫吸附法檢測外分泌細胞因子水平：提取培養(yǎng)6d、12d和21d的Ag-DC-CIK細胞上清液，檢測細胞外分泌細胞因子IL-2、TNF-α、INF-γ含量隨培養(yǎng)天數的變化。 5、Ag-DC-CIK對MGC-803細胞增殖及凋亡的作用：將培養(yǎng)18d的效應細胞和靶細胞混合培養(yǎng)(E:T=20:1

8、)24h后，收集細胞，加入Hoechst 33342至終濃度為1ug/ml，37℃孵育10min，離心，棄染液。加入PI染液重懸避光染色。流式細胞儀分析藍色熒光對紅色熒光的散點圖或地形圖。正常細胞為低藍光/低紅光，凋亡細胞為高藍光/低紅光，壞死細胞為低藍光/高紅光。 結果： 1、單獨培養(yǎng)的CIK細胞在第3d開始增殖，第5-6d進入快速增殖期，CIK細胞和DC(包括負載和未負載MGC-803抗原)共培養(yǎng)后的第12d開始，共

9、培養(yǎng)細胞組的增殖速度開始明顯增快，并快于同源CIK細胞(p<0.05)。 2、健康成年PBMC在體外可以分別由IL-2、CD3McAb、IL-1α、INF-γ和GM-CSF、IL-4誘導出經表型鑒定為成熟的CIK和DC細胞。其中有(79.64±3.41)％的細胞表達成熟DC特異性表面標志CD83，(95.17±1.22)％的細胞表達HLA-DR，(94.66±2.42)％的細胞表達CD86，(86.59±1.09)％的細胞表達C

10、D40。與DC共培養(yǎng)的CIK細胞在培養(yǎng)第14d時CD3+CD8+、CD3+CD56+雙陽性細胞的百分含量進一步升高到59.39％-60.46％和35.67％-36.90％，經抗原刺激過的DC與CIK共培養(yǎng)14d后，混合細胞中CD3+CD8+、CD3+CD56+細胞最多，達到63.63％-65.42％和51.03％-53.15％，與CIK組和DC-CIK組相比均具有顯著性差異(p＜0.05)。 3、在2.5:1-20:1效靶比范圍

11、內，DC-CIK對MGC-803靶細胞的殺傷活性一般均高于同源CIK細胞，經MGC-803細胞凍融物致敏的Ag-DC-CIK共培養(yǎng)細胞對MGC-803靶細胞的殺傷活性有進一步的提高，與單純CIK細胞組比較差異顯著(p＜0.05)，與DC-CIK共培養(yǎng)細胞組比較也有顯著性差異(p＜0.05)。 4、IFN-γ在21d的混合細胞上清液中表達較高，TNF-α在各個時期均能檢測到，但表達水平變化很明顯，在第6d時低表達，21d時較高。促

12、炎因子IL-2變化正好與TNF-α相反，主要在第6d高表達，21d時表達相對較低或不表達。 5、24h組凋亡早期、中期、晚期細胞及正常細胞在FCM散點圖中占絕大多數比例，而48h組以壞死細胞為主，凋亡細胞已較24h明顯減少。 結論： 1、負載MGC-803胃癌細胞抗原的DC可使CIK的增殖速度進一步提高。 2、負載MGC-803抗原的DC與CIK共培養(yǎng)后可使具備攻擊能力的主要細胞群CD3+CD8+、CD3

13、+CD56+雙陽性細胞群比例分別進一步提高。 3、經抗原沖擊的DC與CIK共培養(yǎng)后能增強其對胃癌細胞MGC-803的殺傷活性。 4、Ag-DC-CIK在體外培養(yǎng)過程中不僅需要持續(xù)來源于外界細胞因子的存在，而且該效應細胞組還能夠向細胞外分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2影響其自身的功能。 5、在效靶相互作用初期，Ag-DC-CIK對MGC-803的殺傷作用主要通過誘導腫瘤細胞凋亡，同時發(fā)生自身凋亡來實現(xiàn)；在相互作