糖酵解抑制劑對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、[目的]:探討糖酵解抑制劑3-溴丙酮酸(BP)和檸檬酸鈉（SCT）抑制胃癌細(xì)胞MGC-803生長(zhǎng)和增殖的作用及其機(jī)制，為3-溴丙酮酸和檸檬酸鈉進(jìn)行臨床試驗(yàn)和進(jìn)一步胃癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　[方法]培養(yǎng)低分化人胃癌細(xì)胞株MGC-803，并隨機(jī)分為8組，即3-溴丙酮酸低、中、高濃度組(4、6、8ug/ml)，檸檬酸鈉低、中、高濃度組(5、10、20mmol/L)，陽(yáng)性對(duì)照5-Fu組（0.5mmol/L）以及空白對(duì)照組（Control

2、）。經(jīng)過(guò)不同濃度的BP和SCT作用后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)BP和SCT的敏感性;流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)BP和SCT對(duì)細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞周期分布的影響，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)糖酵解途徑關(guān)鍵酶己糖激酶(HK)和磷酸果糖激酶-1(PFK-1)的活性、乳酸含量和三磷酸腺苷(ATP)水平的變化，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、bax、Cyt-C和Suvivin等基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量，蛋白印跡法(Westernblot)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)B

3、cl-2、Bax、Cyt-C和Suvivin等蛋白相對(duì)表達(dá)量。
　　[結(jié)果]
　　1.BP和SCT分別對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803分別作用后，細(xì)胞的增殖抑制率均隨著B(niǎo)P和SCT作用濃度的增大呈增高的趨勢(shì)，且隨藥物作用時(shí)間的增大呈增高的趨勢(shì)。BP和SCT對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803作用48h的IC50分別為5.73±0.75ug/ml和10.08±0.87mmol/L。鏡下觀察每個(gè)視野內(nèi)，BP和SCT各濃度組和5-FU組細(xì)胞總數(shù)比空白

4、對(duì)照組少，而形態(tài)變圓、出現(xiàn)核固縮的細(xì)胞比空白對(duì)照組多，且呈濃度依賴(lài)的趨勢(shì)。
　　2.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的BP分別對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803作用24h、48h后，其凋亡率從10.67％增加到76.19％，與空白對(duì)照組相比，具有顯著性差異。同時(shí)，不同濃度的SCT分別對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803作用24h、48h后，其凋亡率從15.61％增加到83.10％，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5-FU組24h、48h的凋亡率

5、分別為50.52％和86.06％，與空白對(duì)照組相比，均具有顯著性差異;此外，BP對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803作用24h后，隨著B(niǎo)P濃度的增大，其細(xì)胞周期阻滯在G2/M期的細(xì)胞比例從14.49％增加到39.39％，而SCT對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803作用24h后，隨著SCT濃度的增大，其細(xì)胞周期阻滯在G2/M期的細(xì)胞比例從13.51％增加到41.24％，與空白對(duì)照組相比，均具有顯著性差異。5-FU組細(xì)胞周期阻滯在G2/M期的細(xì)胞比例為21.93％

6、，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.BP和SCT均能有效地降低胃癌細(xì)胞MGC-803內(nèi)ATP和乳酸的生成。不同濃度的BP分別對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803作用4h、8h后，細(xì)胞內(nèi)ATP含量從30.79umol/gprot減少到7.31 umol/gprot，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而不同濃度的SCT分別對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803作用4h、8h后，細(xì)胞內(nèi)ATP含量從28.24umol/gprot減少到6.76um

7、ol/gprot，與空白對(duì)照組相比，具有顯著性差異。5-FU組4h、8h細(xì)胞內(nèi)ATP含量分別為20.21umol/gprot和10.34umol/gprot，均比空白對(duì)照組顯著降低。此外，不同濃度的BP分別對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803作用24h、48h后，細(xì)胞內(nèi)乳酸含量從84.91 umol/gprot減少到18.92umol/gprot，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而不同濃度的SCT分別對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803作用24h、48h

8、后，細(xì)胞內(nèi)乳酸含量從78.87umol/gprot減少到11.44umol/gprot，與空白對(duì)照組相比，具有顯著性差異。5-FU組24h、48h細(xì)胞內(nèi)乳酸含量分別為106.45 umol/gprot和113.98 umol/gprot，與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異。
　　4.BP和SCT能夠分別選擇地抑制胃癌細(xì)胞MGC-803內(nèi)HK和PFK-1的活性。不同濃度的BP分別對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803作用24h、48h后，細(xì)胞內(nèi)HK的活性從

9、8.67u/gprot降低到1.98u/gprot，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而不同濃度的SCT分別對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803作用24h、48h后，細(xì)胞內(nèi)HK活性均無(wú)明顯變化，與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5-FU組24h、48h的細(xì)胞內(nèi)HK活性分別為11.45u/gprot和10.99u/gprot，與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異。此外，不同濃度的SCT分別對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803作用24h、48h后，細(xì)胞內(nèi)PFK-1的活性

10、從19.01u/gprot降低到2.51u/gprot，與空白對(duì)照組相比，具有顯著性差異，而不同濃度的BP分別對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803作用24h、48h后，細(xì)胞內(nèi)PFK-1的活性均無(wú)明顯變化，與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5-FU組24h、48h的細(xì)胞內(nèi)PFK-1活性分別為25.3 lu/gprot和27.79u/gprot，與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異。
　　5.BP和SCT均能抑制胃癌細(xì)胞MGC-803內(nèi)Bcl-2和Surv

11、ivin基因的mRNA和蛋白的表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量均隨著B(niǎo)P和SCT作用濃度的增大呈降低的趨勢(shì)。此外，BP和SCT均能呈濃度依賴(lài)性地促進(jìn)胃癌細(xì)胞MGC-803內(nèi)Bax和Cyt-C基因的mRNA和蛋白的表達(dá)。5-FU也能有效地抑制胃癌細(xì)胞MGC-803內(nèi)Bcl-2和Survivin基因的mRNA和蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bax和Cyt-C基因的mRNA和蛋白的表達(dá)，與空白對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　[結(jié)論]BP和SCT對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC