新型手性二氫吡唑類化合物靶向hTERT抑制胃癌細(xì)胞MGC-803增殖的作用機(jī)制研究.pdf

1、癌細(xì)胞的永生化是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵,而端粒酶是維持癌細(xì)胞持續(xù)增殖的關(guān)鍵酶。目前發(fā)現(xiàn)約90％腫瘤細(xì)胞的端粒酶都有活性,而大多數(shù)正常細(xì)胞的端粒酶一般無活性。因此,端粒酶是一種十分有價值的腫瘤標(biāo)志物,已成為化療藥物的新靶點(diǎn)。二氫吡唑類化合物已證實(shí)具有抗癌、抗炎及抗病毒等生物活性,但其作用機(jī)制未明。因此,本課題組計算機(jī)模擬、設(shè)計并合成81個靶向端粒酶活性亞單位hTERT的新型手性二氫吡唑類化合物作為潛在的端粒酶抑制劑。
　　通過前期在前

2、列腺癌PC3、乳腺癌Bcap-37及胃癌MGC-803細(xì)胞株篩選發(fā)現(xiàn)化合物10i、10n、11i、13i及13k抑制MGC-803細(xì)胞增殖作用較好,IC50值分別為3.51±0.21μM、3.01±0.13μM、2.02±0.23μM、2.96±0.15μM及1.41±0.17μM。其中,化合物13k的抗癌活性最高;另一方面其對人正常細(xì)胞GES-1和L-02的毒性較小,其IC50值在mM級別。而且,通過改良的TRAP實(shí)驗發(fā)現(xiàn)化合物13k

3、同時表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制端粒酶活性作用,其IC50值為0.86±0.05μM,以上結(jié)果提示化合物13k可能是一個高效、高選擇性的潛在端粒酶抑制劑。另外,分子對接的2D和3D圖提示13k靶向hTERT,并且加藥組hTERT表達(dá)下調(diào)及端粒酶活性下降,進(jìn)一步驗證其靶向性。
　　為了進(jìn)一步探討化合物13k靶向hTERT發(fā)揮抑制MGC-803細(xì)胞增殖作用的機(jī)制,首先通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)化合物13k處理48h后G0/G1期細(xì)胞數(shù)顯著增多

4、;且與空白對照組相比,cyclin D1表達(dá)減少,這提示化合物13k抑制細(xì)胞增殖是通過阻滯細(xì)胞于G0/G1期實(shí)現(xiàn)。其次,RT-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)化合物13k靶向hTERT能下調(diào)MGC-803細(xì)胞Wnt通路中關(guān)鍵分子β-catenin及下游與增殖相關(guān)的信號分子如c-Myc和cyclin D1 mRNA和蛋白的表達(dá),這提示化合物13k靶向hTERT能抑制MGC-803細(xì)胞增殖,與Wnt/β-catenin通路有關(guān)。

5、r>　　再次,應(yīng)用端粒酶抑制劑AZT、hTERT-siRNA沉默及pCI-neo-hTERT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等方法觀察hTERT對Wnt/β-catenin經(jīng)典信號通路的影響。RT-PCR和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MGC-803中β-catenin、cyclin D1和c-Myc的水平能隨著hTERT表達(dá)的下降而降低,反之亦然,即MGC-803中hTERT能直接調(diào)控Wnt/β-catenin經(jīng)典信號通路。最后,化合物13k處理hTER

6、T過表達(dá)的MGC-803細(xì)胞48h后,Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)與hTERT過表達(dá)組相比,加藥后hTERT、β-catenin、cyclin D1及c-Myc表達(dá)均下降。
　　綜上所述,本課題組基于合理的藥物分子設(shè)計的基礎(chǔ)上設(shè)計并合成一系列新型手性二氫吡唑類化合物靶向 hTERT,并從中篩選一個高效高選擇性的潛在端粒酶抑制劑——化合物13k,并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)化合物13k靶向hTERT,抑制端粒酶活性和hTER