新型線粒體靶向性鉑類(lèi)化合物的抗細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞遷移的研究.pdf

1、目的：繼順鉑問(wèn)世以來(lái)，人們合成了數(shù)千種類(lèi)似的鉑化合物，其中大約30種進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，不足10種獲得上市,但在臨床上得到廣泛應(yīng)用的只有3種，分別是卡鉑、奈達(dá)鉑和奧沙利鉑。目前，亞細(xì)胞靶向性的鉑類(lèi)配合物成為研究熱點(diǎn)，研究作用于細(xì)胞核DNA以外的其它位置是否可以提高抗癌藥的效果。線粒體是真核細(xì)胞生存不可或缺的，它在細(xì)胞的生理和病理中發(fā)揮了重要作用，其中包括通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生 ATP，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，可以激活體內(nèi)的凋亡和壞死途徑。由于線粒體

2、可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的基本功能，所以線粒體功能失調(diào)與腫瘤發(fā)生和預(yù)后有很大關(guān)系。實(shí)際上，正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的線粒體在結(jié)構(gòu)和功能上有所不同，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的代謝比較旺盛，所以腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞更易受到線粒體干擾。線粒體靶向性的抗癌藥在提高治療效果方面成為一大熱點(diǎn)，它可以產(chǎn)生較少耐藥性和抑制細(xì)胞遷移。
　　本實(shí)驗(yàn)室成功合成一類(lèi)線粒體靶向性的鉑類(lèi)化合物，其殺死腫瘤細(xì)胞的效果明顯高于傳統(tǒng)藥物順鉑,但是對(duì)腫瘤細(xì)胞的其他生物學(xué)效應(yīng)尚未進(jìn)行研究。本研究旨在

3、通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)和對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲方面影響的研究，希望找到抗癌效果強(qiáng)，但對(duì)正常細(xì)胞毒性小，而且能夠抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲的抗癌藥物。
　　方法：本課題組成功合成幾種線粒體靶向性的新型鉑類(lèi)化合物，與順鉑作用于細(xì)胞核DNA不同，我們合成的鉑類(lèi)化合物與線粒體DNA結(jié)合，由于線粒體中的DNA缺乏組蛋白和核苷酸切除修復(fù)途徑，可以避免損傷的DNA被DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)，且我們的鉑類(lèi)化合物具有一定的空間結(jié)構(gòu)，可以避免在與DNA結(jié)合

4、前與含硫大分子結(jié)合，從而增加細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，增強(qiáng)抗癌效果。本研究做了以下方面的工作：(1)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(CCK-8)，比較幾種新型線粒體靶向性的鉑類(lèi)化合物Pt-platin與傳統(tǒng)鉑類(lèi)化合物順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞(A549、HeLa、HepG2、MCF7)、正常細(xì)胞(MRC5)和耐順鉑的肺癌細(xì)胞(A549/DDP)的毒性；(2)體內(nèi)腫瘤模型：雄性小鼠后背注入4TI細(xì)胞建立體內(nèi)腫瘤模型，當(dāng)腫瘤大小達(dá)到大約100mm3時(shí)，瘤內(nèi)注射PIP-platin

5、，連續(xù)觀察30天，測(cè)量腫瘤大小，對(duì)照組注射PBS溶液；(3)以 A549為細(xì)胞模型，PIP-platin為代表，流式細(xì)胞儀和電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)被用來(lái)檢測(cè)藥物在37℃不同時(shí)間或4℃時(shí)進(jìn)入細(xì)胞的量；(4)為進(jìn)一步研究藥物內(nèi)吞機(jī)制，在PIP-platin處理細(xì)胞之前，用四種抑制劑：諾考達(dá)唑(nacodazole,微管抑制劑),氯丙嗪(chlorpromazine,抑制Rho GTP酶),氯喹(chloroquine,抑制核

6、內(nèi)體酸化),布雷非德菌素 A(brefeldin,抑制蛋白運(yùn)輸?shù)礁郀柣w)預(yù)先處理細(xì)胞，然后用 ICP-MS檢測(cè)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的鉑元素含量；(5)激光共聚焦顯微鏡觀察PIP-platin是否和線粒體共定位，以及提取細(xì)胞線粒體，分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總的內(nèi)吞量和蛋白量、線粒體中的內(nèi)吞量和蛋白量，進(jìn)一步驗(yàn)證PIP-platin是否主要聚集在線粒體中；(6)透射電子顯微鏡(TEM)觀察細(xì)胞加了 PIP-platin后線粒體的形態(tài)變化；(7)流式細(xì)胞儀檢測(cè)

7、藥物作用后細(xì)胞周期和凋亡率的改變；(8)通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平、線粒體膜電位的改變、ATP的合成、細(xì)胞色素C的變化、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（Bax，Bcl-2）的表達(dá)，來(lái)研究藥物對(duì)線粒體功能的影響；(9)另外，建立2D和3D細(xì)胞模型，利用細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)、Transwell技術(shù)來(lái)探討PIP-platin對(duì)細(xì)胞粘附、遷移、侵襲的影響；(10)熒光顯微鏡觀察粘附相關(guān)蛋白?-catenin是否會(huì)聚集在細(xì)胞膜上；(11)Western blo

8、t檢測(cè)粘附相關(guān)蛋白FAK和p-FAK表達(dá)量的改變；(12)研究PIP-platin對(duì)Wnt信號(hào)的影響，以及?-catenin蛋白在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)量。
　　結(jié)果：細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明新型線粒體靶向性的鉑類(lèi)化合物均能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，具有劑量依賴(lài)性，對(duì)細(xì)胞的半數(shù)致死濃度(IC50)均小于順鉑，在所有的Pt-platin中，PIP-platin對(duì)正常細(xì)胞 MRC-5的毒性(IC50=20.25?g/mL)比其他腫瘤細(xì)胞小(IC5

9、0=7-14?g/mL)；PIP-platin使體內(nèi)腫瘤減小大約77％，p<0.05，而PBS對(duì)照組腫瘤大小幾乎沒(méi)變化；流式細(xì)胞儀和ICP-MS均顯示隨著時(shí)間增加，細(xì)胞內(nèi)鉑金屬的含量隨著增加，在4℃時(shí)內(nèi)吞減少；Nacodazole能抑制細(xì)胞內(nèi)吞，而其它三種溶酶體抑制劑均未抑制內(nèi)吞；激光共聚焦照片顯示 PIP-platin能與線粒體共定位，Pearson相關(guān)系數(shù)大于0.8，線粒體提取后，線粒體中的鉑金屬內(nèi)吞量為0.99 nmol Pt/m

10、g，大于細(xì)胞總的內(nèi)吞量(0.35 nmol Pt/mg)；TEM結(jié)果顯示5?g/mL PIP-platin破壞細(xì)胞線粒體，使線粒體膜不完整，線粒體嵴減少；PIP-platin處理細(xì)胞后，從5?g/mL開(kāi)始，細(xì)胞內(nèi)的 ROS水平比對(duì)照組明顯增多，p<0.05；PIP-platin使線粒體膜電位降低、細(xì)胞內(nèi)的ATP合成減少、細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中、Bax/Bcl-2比例增加、細(xì)胞周期阻滯在S期；由凋亡實(shí)驗(yàn)可知，由PIP-plati

11、n引起的細(xì)胞凋亡具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性，但從20?g/mL開(kāi)始才能引起明顯的凋亡；2D模型中，我們發(fā)現(xiàn)，PIP-platin處理的細(xì)胞難以消化、粘附增加，劃痕實(shí)驗(yàn)顯示PIP-platin可抑制腫瘤細(xì)胞遷移，transwell實(shí)驗(yàn)顯示加藥組從transwell上室遷移到下室的細(xì)胞數(shù)減少，進(jìn)一步證明 PIP-platin可以抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲；3D細(xì)胞模型模擬了體內(nèi)環(huán)境，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞球面積小于對(duì)照組，并與劃痕實(shí)驗(yàn)及transwe

12、ll的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的；熒光顯微鏡圖片顯示?-catenin在細(xì)胞膜聚集；FAK蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，但是FAK磷酸化蛋白p-FAK蛋白表達(dá)情況有改變，先升高然后下降；PIP-platin抑制Wnt信號(hào)；PIP-platin使?-catenin在細(xì)胞膜上的量增加，但進(jìn)入細(xì)胞核的量減少。
　　結(jié)論：
　　1. PIP-platin的毒性比經(jīng)典抗癌藥順鉑大，且對(duì)正常細(xì)胞毒性小。
　　2. PIP-platin成功靶向到線粒體

13、中，與線粒體共定位，破壞線粒體，使線粒體形態(tài)發(fā)生變化，比如：線粒體膜不完整、線粒體內(nèi)嵴減少等。
　　同時(shí)，PIP-platin可以導(dǎo)致線粒體功能受損，具體表現(xiàn)在：過(guò)量的活性氧、線粒體膜電位降低、ATP合成減少、細(xì)胞色素C從線粒體釋放、Bax/Bcl-2的比例增加、在細(xì)胞周期的S期阻滯。
　　3. PIP-platin增加細(xì)胞粘附、抑制細(xì)胞遷移和侵襲；
　　PIP-platin影響粘附相關(guān)蛋白FAK和p-FAK表達(dá)；