新型線粒體靶向性鉑類化合物的抗細胞增殖和抑制細胞遷移的研究.pdf

1、目的：繼順鉑問世以來，人們合成了數(shù)千種類似的鉑化合物，其中大約30種進入臨床試驗階段，不足10種獲得上市,但在臨床上得到廣泛應(yīng)用的只有3種，分別是卡鉑、奈達鉑和奧沙利鉑。目前，亞細胞靶向性的鉑類配合物成為研究熱點，研究作用于細胞核DNA以外的其它位置是否可以提高抗癌藥的效果。線粒體是真核細胞生存不可或缺的，它在細胞的生理和病理中發(fā)揮了重要作用，其中包括通過氧化磷酸化產(chǎn)生 ATP，當細胞受到損傷時，可以激活體內(nèi)的凋亡和壞死途徑。由于線粒體

2、可以調(diào)節(jié)細胞的基本功能，所以線粒體功能失調(diào)與腫瘤發(fā)生和預(yù)后有很大關(guān)系。實際上，正常細胞和腫瘤細胞的線粒體在結(jié)構(gòu)和功能上有所不同，因為腫瘤細胞的代謝比較旺盛，所以腫瘤細胞比正常細胞更易受到線粒體干擾。線粒體靶向性的抗癌藥在提高治療效果方面成為一大熱點，它可以產(chǎn)生較少耐藥性和抑制細胞遷移。
　　本實驗室成功合成一類線粒體靶向性的鉑類化合物，其殺死腫瘤細胞的效果明顯高于傳統(tǒng)藥物順鉑,但是對腫瘤細胞的其他生物學(xué)效應(yīng)尚未進行研究。本研究旨在

3、通過對腫瘤細胞的生物學(xué)效應(yīng)和對腫瘤細胞遷移和侵襲方面影響的研究，希望找到抗癌效果強，但對正常細胞毒性小，而且能夠抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲的抗癌藥物。
　　方法：本課題組成功合成幾種線粒體靶向性的新型鉑類化合物，與順鉑作用于細胞核DNA不同，我們合成的鉑類化合物與線粒體DNA結(jié)合，由于線粒體中的DNA缺乏組蛋白和核苷酸切除修復(fù)途徑，可以避免損傷的DNA被DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)，且我們的鉑類化合物具有一定的空間結(jié)構(gòu)，可以避免在與DNA結(jié)合

4、前與含硫大分子結(jié)合，從而增加細胞內(nèi)藥物濃度，增強抗癌效果。本研究做了以下方面的工作：(1)細胞毒性實驗(CCK-8)，比較幾種新型線粒體靶向性的鉑類化合物Pt-platin與傳統(tǒng)鉑類化合物順鉑對腫瘤細胞(A549、HeLa、HepG2、MCF7)、正常細胞(MRC5)和耐順鉑的肺癌細胞(A549/DDP)的毒性；(2)體內(nèi)腫瘤模型：雄性小鼠后背注入4TI細胞建立體內(nèi)腫瘤模型，當腫瘤大小達到大約100mm3時，瘤內(nèi)注射PIP-platin

5、，連續(xù)觀察30天，測量腫瘤大小，對照組注射PBS溶液；(3)以 A549為細胞模型，PIP-platin為代表，流式細胞儀和電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)被用來檢測藥物在37℃不同時間或4℃時進入細胞的量；(4)為進一步研究藥物內(nèi)吞機制，在PIP-platin處理細胞之前，用四種抑制劑：諾考達唑(nacodazole,微管抑制劑),氯丙嗪(chlorpromazine,抑制Rho GTP酶),氯喹(chloroquine,抑制核

6、內(nèi)體酸化),布雷非德菌素 A(brefeldin,抑制蛋白運輸?shù)礁郀柣w)預(yù)先處理細胞，然后用 ICP-MS檢測進入細胞內(nèi)的鉑元素含量；(5)激光共聚焦顯微鏡觀察PIP-platin是否和線粒體共定位，以及提取細胞線粒體，分別檢測細胞內(nèi)總的內(nèi)吞量和蛋白量、線粒體中的內(nèi)吞量和蛋白量，進一步驗證PIP-platin是否主要聚集在線粒體中；(6)透射電子顯微鏡(TEM)觀察細胞加了 PIP-platin后線粒體的形態(tài)變化；(7)流式細胞儀檢測

7、藥物作用后細胞周期和凋亡率的改變；(8)通過檢測細胞內(nèi)ROS水平、線粒體膜電位的改變、ATP的合成、細胞色素C的變化、細胞凋亡相關(guān)蛋白（Bax，Bcl-2）的表達，來研究藥物對線粒體功能的影響；(9)另外，建立2D和3D細胞模型，利用細胞粘附實驗、遷移實驗、Transwell技術(shù)來探討PIP-platin對細胞粘附、遷移、侵襲的影響；(10)熒光顯微鏡觀察粘附相關(guān)蛋白?-catenin是否會聚集在細胞膜上；(11)Western blo

8、t檢測粘附相關(guān)蛋白FAK和p-FAK表達量的改變；(12)研究PIP-platin對Wnt信號的影響，以及?-catenin蛋白在細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核中的表達量。
　　結(jié)果：細胞毒性實驗表明新型線粒體靶向性的鉑類化合物均能抑制細胞生長，具有劑量依賴性，對細胞的半數(shù)致死濃度(IC50)均小于順鉑，在所有的Pt-platin中，PIP-platin對正常細胞 MRC-5的毒性(IC50=20.25?g/mL)比其他腫瘤細胞小(IC5

9、0=7-14?g/mL)；PIP-platin使體內(nèi)腫瘤減小大約77％，p<0.05，而PBS對照組腫瘤大小幾乎沒變化；流式細胞儀和ICP-MS均顯示隨著時間增加，細胞內(nèi)鉑金屬的含量隨著增加，在4℃時內(nèi)吞減少；Nacodazole能抑制細胞內(nèi)吞，而其它三種溶酶體抑制劑均未抑制內(nèi)吞；激光共聚焦照片顯示 PIP-platin能與線粒體共定位，Pearson相關(guān)系數(shù)大于0.8，線粒體提取后，線粒體中的鉑金屬內(nèi)吞量為0.99 nmol Pt/m

10、g，大于細胞總的內(nèi)吞量(0.35 nmol Pt/mg)；TEM結(jié)果顯示5?g/mL PIP-platin破壞細胞線粒體，使線粒體膜不完整，線粒體嵴減少；PIP-platin處理細胞后，從5?g/mL開始，細胞內(nèi)的 ROS水平比對照組明顯增多，p<0.05；PIP-platin使線粒體膜電位降低、細胞內(nèi)的ATP合成減少、細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)中、Bax/Bcl-2比例增加、細胞周期阻滯在S期；由凋亡實驗可知，由PIP-plati

11、n引起的細胞凋亡具有劑量和時間依賴性，但從20?g/mL開始才能引起明顯的凋亡；2D模型中，我們發(fā)現(xiàn)，PIP-platin處理的細胞難以消化、粘附增加，劃痕實驗顯示PIP-platin可抑制腫瘤細胞遷移，transwell實驗顯示加藥組從transwell上室遷移到下室的細胞數(shù)減少，進一步證明 PIP-platin可以抑制腫瘤細胞遷移和侵襲；3D細胞模型模擬了體內(nèi)環(huán)境，結(jié)果表明，實驗組的細胞球面積小于對照組，并與劃痕實驗及transwe

12、ll的實驗結(jié)果是一致的；熒光顯微鏡圖片顯示?-catenin在細胞膜聚集；FAK蛋白表達無明顯變化，但是FAK磷酸化蛋白p-FAK蛋白表達情況有改變，先升高然后下降；PIP-platin抑制Wnt信號；PIP-platin使?-catenin在細胞膜上的量增加，但進入細胞核的量減少。
　　結(jié)論：
　　1. PIP-platin的毒性比經(jīng)典抗癌藥順鉑大，且對正常細胞毒性小。
　　2. PIP-platin成功靶向到線粒體

13、中，與線粒體共定位，破壞線粒體，使線粒體形態(tài)發(fā)生變化，比如：線粒體膜不完整、線粒體內(nèi)嵴減少等。
　　同時，PIP-platin可以導(dǎo)致線粒體功能受損，具體表現(xiàn)在：過量的活性氧、線粒體膜電位降低、ATP合成減少、細胞色素C從線粒體釋放、Bax/Bcl-2的比例增加、在細胞周期的S期阻滯。
　　3. PIP-platin增加細胞粘附、抑制細胞遷移和侵襲；
　　PIP-platin影響粘附相關(guān)蛋白FAK和p-FAK表達；