番荔枝二萜類化合物抑制肝癌增殖及其機(jī)制的研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌是最常見的人類致死性惡性腫瘤之一，對人類健康危害極大。我國是原發(fā)性肝癌的高發(fā)國家之一，死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中列第三位，僅次于胃癌和食道癌，但目前肝癌的中、晚期治療，尚無有效的方法，中醫(yī)藥作為綜合治療的重要組成部分，有一定的療效和獨特的優(yōu)勢，成為肝癌治療的重要手段之一，而發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢，用分子生物學(xué)方法研究中醫(yī)藥防治肝癌，提高肝癌的治療效果，一直是我國肝癌研究的重要課題。近年來，中藥有效成分和提取物抗腫瘤的研究一直是國內(nèi)研究

2、的熱點，目前，國內(nèi)外在番荔枝抗腫瘤的研究方面取得了一定的進(jìn)展，以章永紅教授為首的科研組初步的動物體內(nèi)抗腫瘤實驗結(jié)果表明，番荔枝提取物對小鼠移植性肉瘤S180有明顯的抗腫瘤活性，以50mg／kg×7d劑量灌胃給藥，其抑瘤率可達(dá)41％。同時研究了圓滑番荔枝中其中一個二萜類化合物對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的抑制作用及其機(jī)理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)SMMC-7721癌細(xì)胞凋亡，抑制Bc1-2基因的表達(dá)，增加bax基因的表達(dá)。本研究旨在為從番荔枝中

3、尋找新的有效治療肝癌的約物提供理論依據(jù)。 研究目的 本課題將從番荔枝中提出的5種二萜類化合物中篩選出抗癌活性強(qiáng)的單體成份，并從體外和體內(nèi)兩個方面評價其抗肝癌作用，在分子生物學(xué)水平初步闡明其抗腫瘤機(jī)制。為研制一種新型抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)，同時為臨床運用番荔枝進(jìn)行抗癌治療提供客觀依據(jù)和一定的理論支持。 研究方法 體外實驗： 1．活性番荔枝二萜類化合物單體的篩選 采用MTT法，觀察5種番荔枝二萜類

4、化合物單體對體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株HepG2 SMMC7721的抑制作用，并考察其量效和時效關(guān)系。篩選出對HepG2抑制作用強(qiáng)的單體。 2．活性番荔枝二萜類化合物單體抗腫瘤作用機(jī)理探討 (1)活性番荔枝二萜類化合物單體體外誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC7721調(diào)亡的研究 A．倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。 B．熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)的變化(AO∥EB，Hoechst33258熒光染色法)。

5、 C．透視電子顯微鏡(TEM)觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，以觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞山芽，凋亡小體，胞漿內(nèi)空泡和核染色質(zhì)同縮，碎裂，邊集等現(xiàn)象利線粒體嵴的變化。 D．瓊脂糖凝膠電泳分析腫瘤細(xì)胞內(nèi)生化指標(biāo)的變化，看是否有DNA Iadder出現(xiàn)。 E．流式細(xì)胞術(shù)觀察有無sub-G1峰出現(xiàn)，檢測細(xì)胞凋亡率，并進(jìn)行細(xì)胞周期分析。 從以上五種方法米確定活性番荔枝二萜類化合物單體是否以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方式米抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

6、 (2)活性番荔枝二萜類化合物單體體外誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株HepG2調(diào)亡機(jī)制的研究 A．激光共聚焦技術(shù)(LSM)檢測活性番荔枝二萜類化合物對細(xì)胞膜電位(MP)、線粒體電位(△ψm)以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響。 B．基因微矩陣技術(shù)檢測活性褥荔枝二萜類化合物對腫瘤細(xì)胞內(nèi)與凋亡相關(guān)基因的變化 C．采用Western blot和檢測與凋亡相關(guān)的基因Bax、Bcl-2、Caspase-3的變化，體內(nèi)實驗： 1．觀

7、察活性番荔枝二萜類化合物單體的抑瘤作用及副作用 采用移植性肝癌小鼠模型(HepS)，觀察活性番荔枝二萜類化合物單體的抑瘤作用，以及對小鼠血常規(guī)、生化指標(biāo)的影響。 2．觀察活性番荔枝二萜類化合物單體對移植性肝癌小鼠模型(HepS)免疫器官脾、胸腺及NK細(xì)胞的影響。 3．免疫組化法觀察活性番荔枝二萜類化合物單體對移植性肝癌小鼠模型(HepS)體內(nèi)與凋亡的基因Bax、Bc1-2、VEGF表達(dá)的影響。 研究結(jié)果

8、 1.5種番荔枝化合物中，L2-11、L2-26兩種化合物對人肝癌細(xì)胞HepG2，SMMC7721增殖呈明顯抑制作用，且隨藥物濃度的提高和作用時間的延長而增強(qiáng)，其中，L2-26作用強(qiáng)于L2-11，L2-26作用72h其對HepG2、SMMC7721最高抑制率分別為85.02％和84.59％，半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為47.2μ M／L53.33μM／L，L2-11最高抑制率分別為77.73％和69.55％。IC50分別為71.

9、38μm／L、84.72μM／L。 2．L2-26作用人肝癌細(xì)胞HepG2后，在熒光顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡下觀察到細(xì)胞凋亡的特征形態(tài)改變，如細(xì)胞體積縮小，胞膜皺縮，表面微絨毛消失，核固縮、沿核膜分布等，流式細(xì)胞儀定量分析在DNA直方圖上各濃度組均見有亞二倍體峰的出現(xiàn)。L2-26作用24h后，出現(xiàn)ladder帶。 3．L2-11作用于人肝癌細(xì)胞株SMMC7721，倒置顯微鏡出現(xiàn)細(xì)胞變小、變園，Hochest33258熒

10、光顯微鏡觀察，亦出現(xiàn)部分細(xì)胞膜皺縮，核變小，染色質(zhì)濃集，等典型的凋亡特征，透射電鏡觀察出現(xiàn)新月型核、凋亡小體等凋亡圖像，流式細(xì)胞儀定量分析在DNA直方圖上各濃度組均見有亞二倍體峰的出現(xiàn)。 4．基因表達(dá)譜測定顯示，在100點芯片數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果中發(fā)現(xiàn)：總數(shù)為100個基因中，與空白組比較，在L2-26給藥組中，上調(diào)基因2倍以上的為29個，3倍以上的為13個，4倍以上的為10個，5倍以上的為8個，6倍以上的為7個，基因下調(diào)2倍以上的為28

11、個，其中上調(diào)最明顯的為MCF{6(C2LSpaSe-9)基因，為空白組的13.5倍。主要出現(xiàn)Apaf1表達(dá)，上調(diào)Bad、Caspase-2，3，8，9、Fas、DR3、DR5、TNFA表達(dá)，下調(diào)Bc1-2、NAIP、c-IAP-1、AP13表達(dá)。 5．激光共聚焦顯微鏡觀察：L2-26作用HepG2細(xì)胞后4h，Ca<'2+>明顯升高，8h胞漿Ca2+略有下降，12h胞漿內(nèi)Ca<'2+>濃度仍維持在較高水平；同時L2-26能促進(jìn)He

12、pG2細(xì)胞膜電位負(fù)值增大，且隨作用時間的增加此作用越明顯，呈一定的時間依賴關(guān)系。L2-26作_用4h、8h、12h后，線粒體膜屯位下降。 6．Western-blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)L2-26作用24小時后，HepG2細(xì)胞Bax蛋白水平未出現(xiàn)明顯增高，而Bcl-2出現(xiàn)抑制，且呈濃度依賴性，濃度越高抑制越明顯，干預(yù)組Bcl-2／Bax-表達(dá)比例下降。caSpaSe-3蛋白水平明顯升高，且呈非常明顯的濃度依賴性。 7．L2-

13、11對小鼠移植性腫瘤Heps在一定劑量下有顯著抑制作用。在本實驗劑量范圍內(nèi)出現(xiàn)明顯量效關(guān)系，其中最大劑量平均抑瘤率分別為48.52％，療效和5FU相當(dāng)；同時L2-11對荷瘤小鼠Heps體重有明顯的增加作用，對免疫器官胸腺、脾臟指數(shù)均有一定程度的增加，NK細(xì)胞活性L2-11 10mg組和陰性對照組相比殺傷活力上升。電鏡L2-11處理組可見明顯的凋亡細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)，流式細(xì)胞儀檢測瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡峰，免疫組化檢測Bax強(qiáng)陽性，Bcl-2、VE

14、GF弱陽性。 研究結(jié)論 1．番荔枝化合物中L-26，L2-11對人肝癌細(xì)胞具有具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，L2-26能誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡，L2-11能誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC7721細(xì)胞的凋亡。 2．L2-26誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制是主要通過線粒體途徑和死亡受體途徑實現(xiàn)的，和出現(xiàn)Apaf1表達(dá)，上調(diào)Bad、Caspase-2，3，8，9、Fas、DR3、DR5、TNFA表達(dá)，下調(diào)Bcl-2、NAIPc-IAP-1、A