樟芝深層液態(tài)發(fā)酵及其三萜類化合物的研究.pdf

1、樟芝，別名牛樟菇和牛樟芝，是一種屬于非褶菌目多孔菌科、只長(zhǎng)于臺(tái)灣的擔(dān)子菌。由于其具有很好的生物活性，在臺(tái)灣地區(qū)非常出名。研究表明樟芝具有十分廣泛的生物活性，如保肝，抗乙肝表面抗原，抗氧化，抗癌等。本論文對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的樟芝菌株進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，并觀察了其生物學(xué)特性；以三萜類化合物為主要目標(biāo)，對(duì)樟芝搖瓶培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化；對(duì)樟芝菌絲體進(jìn)行了擴(kuò)大培養(yǎng)并對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中的活性成分進(jìn)行成分分析、提取富集和保肝活性評(píng)價(jià)。
　　 采用的序列分

2、析，對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的樟芝菌種進(jìn)行了鑒定。通過與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)該菌株的18S rDNA和ITS rDNA與樟芝模式菌株一致。進(jìn)一步對(duì)該樟芝菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，并觀察了樟芝深層培養(yǎng)過程中的產(chǎn)孢子情況。
　　 建立了香草醛-高氯酸顯色法用于測(cè)定樟芝三萜類化合物含量。通過實(shí)驗(yàn)確定最佳反應(yīng)條件為：待測(cè)試樣加熱揮去溶劑，然后加入0.3 mL新制的5％香草醛-冰醋酸溶液及1.0 mL高氯酸試劑，在60℃恒溫水浴加熱20 m

3、in，冷卻至室溫，搖勻，在550nm波長(zhǎng)處測(cè)定，該顯色反應(yīng)靈敏度高，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好。
　　 以樟芝三萜產(chǎn)量為目標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了樟芝搖瓶培養(yǎng)條件。優(yōu)化后的培養(yǎng)條件：接種方式采用孢子接種法，接種量為1.53×105個(gè)/mL，溫度為26℃，搖瓶轉(zhuǎn)速為100 rpm，初始pH為4.5，發(fā)酵時(shí)間為12d。優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨10.0，MgSO4為1.0，KH2PO4為2.0，麩皮2.0。在單因素實(shí)

4、驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)顯著影響樟芝生物量和三萜產(chǎn)量的培養(yǎng)基組成進(jìn)行了RCCD優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練，進(jìn)一步采用遺傳算法得到ANN模型中的最佳條件：接種孢子數(shù)為1.09×105個(gè)/mL，葡萄糖濃度為32.93 g/L，蛋白胨濃度為2.81 g/L，黃豆粉濃度為2.01 g/L。搖瓶培養(yǎng)12 d的樟芝胞內(nèi)三萜產(chǎn)量最高可達(dá)63.14 mg/L。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到樟芝三萜產(chǎn)量為55.89±2.43 mg/L，與預(yù)測(cè)值相比，誤差

5、為11.48％。較優(yōu)化前的25.22mg/L提高了121.6％。
　　 研究了香樟樹枝和樹葉不同提取物對(duì)搖瓶培養(yǎng)樟芝生物量和三萜含量的影響。香樟石油醚提取物和乙酸乙酯提取物均能提高樟芝菌絲體中三萜的含量。其中以香樟樹枝石油醚提取物(PES)(0.05 g/L)對(duì)樟芝三萜含量的提高作用最顯著，三萜含量達(dá)到23.20mg/g，比對(duì)照組提高了30.78％。通過GC-MS分析，從PES中共鑒定了39種化合物，主要為萜類化合物(28種，5

6、0.86％)，包括單萜類化合物9種(30.57％)，倍半萜19種(20.29％)。進(jìn)一步考察了PES中所含的L-芳樟醇，蘑菇醇，桉樹腦，樟腦，樟烯，α-松萜，α-松油醇，γ-萜品烯，反式石竹烯等化合物對(duì)樟芝生物量、三萜含量和產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)α-松油醇對(duì)樟芝菌絲體三萜含量、三萜產(chǎn)量均有促進(jìn)作用。α-松油醇能夠促進(jìn)樟芝揮發(fā)性萜類化合物的產(chǎn)生，可能通過影響萜類化合物合成途徑提高樟芝萜類物質(zhì)產(chǎn)量。
　　 在搖瓶培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，對(duì)樟芝菌絲體

7、進(jìn)行了5 L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，并考察了攪拌轉(zhuǎn)速、接種量對(duì)樟芝三萜產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，較優(yōu)的攪拌轉(zhuǎn)速為50 rpm，較優(yōu)的孢子接種量為1.0×105個(gè)/mL。樟芝菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)7 d可以獲得最大的生物量(6.51g/L)，在生長(zhǎng)8 d后胞內(nèi)三萜產(chǎn)量達(dá)到最大(48.90 mg/L)。
　　 對(duì)5L發(fā)酵罐培養(yǎng)所得的樟芝菌絲體深層發(fā)酵產(chǎn)物的成分進(jìn)行了較為全面的分析。結(jié)果表明：樟芝發(fā)酵產(chǎn)物含有鉀、鈣、鈉、鎂、鐵、錳、鋅、銅等8種礦物質(zhì)元素

8、。樟芝菌絲體、孢子粉和發(fā)酵液中飽和脂肪酸的相對(duì)含量分別為55.32％，58.62％和60.79％，包括棕櫚酸和硬脂酸。不飽和脂肪酸相對(duì)含量分別為43.15％，40.52％和39.18％，包括棕櫚油酸，油酸，亞油酸和亞麻酸。樟芝發(fā)酵產(chǎn)物中共檢測(cè)到18種氨基酸，菌絲體和孢子粉的18種氨基酸總量分別為26.49g/100g和30.56g/100g，其中谷氨酸含量最高。樟芝胞內(nèi)多糖和胞外多糖均由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，但是三種單糖在不同多糖

9、中的比例不同。
　　 分別在發(fā)酵液和菌絲體中分析得到49種和55種揮發(fā)性化合物，其中包括22種醇類化合物、8種酮類化合物、7種醛類化合物、23種酯類化合物、5種萜烯類化合物、3種芳香族化合物。樟芝發(fā)酵產(chǎn)物的總體香味主要為蘑菇香，水果香和花香。樟芝的蘑菇味主要由C8脂肪族化合物貢獻(xiàn)，包括3-辛醇，1-辛烯-3-醇等。一些內(nèi)酯類物質(zhì)，比如γ-辛內(nèi)酯和γ-癸內(nèi)酯等，對(duì)樟芝發(fā)酵產(chǎn)物所具有的水蜜桃香味貢獻(xiàn)較大。另外，一些萜烯類和萜醇類化合

10、物(如T-杜松醇、L-芳樟醇等)所具有的植物香味對(duì)樟芝發(fā)酵產(chǎn)物的香味也具有不同程度的貢獻(xiàn)，其中以L-芳樟醇(柑橘味)的香氣強(qiáng)度較大。
　　 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法確定了樟芝胞內(nèi)三萜提取的最優(yōu)工藝參數(shù)。最終確定樟芝三萜提取的最佳工藝條件為：乙醇濃度86％，提取溫度75℃，液固比37，提取次數(shù)2次。在此條件下樟芝三萜得率理論最大值3.23％。同時(shí)對(duì)乙醇提取樟芝胞內(nèi)三萜的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究。根據(jù)Fick第二定律導(dǎo)出的數(shù)學(xué)模型與

11、樟芝胞內(nèi)三萜實(shí)際提取過程較為一致，ln[C∞/(C∞-C)]與時(shí)間t具有良好線性關(guān)系，表明樟芝菌絲體三萜類化合物的溶出速度由孔內(nèi)擴(kuò)散控制。
　　 研究了大孔樹脂富集樟芝胞外三萜的工藝。通過靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附性能的比較，篩選出對(duì)樟芝胞外三萜類化合物吸附性能較好的大孔樹脂XAD-16，并優(yōu)化了其對(duì)三萜類化合物的分離條件：被分離樣品溶液的pH為6.0，溶液中三萜類化合物的初始濃度為0.97mg/mL，流速為2 mL/min，解吸附溶劑為乙

12、醇。大孔樹脂對(duì)于樟芝胞外三萜的吸附主要是通過范德華力、輔以氫鍵作用而進(jìn)行的。通過方程擬合，證明大孔樹脂對(duì)三萜類化合物的吸附為單層吸附。且吸附過程中，溫度升高會(huì)減少吸附量。
　　 建立酒精性肝損傷細(xì)胞模型并對(duì)樟芝發(fā)酵產(chǎn)物的保肝作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，樟芝發(fā)酵產(chǎn)物中對(duì)酒精性肝細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用的物質(zhì)主要存在于菌絲體中，菌絲體乙醇提取物和水提取物均具有保護(hù)酒精性肝細(xì)胞損傷的作用。樟芝菌絲體醇提物(25μg/mL)和水提物(200μ