茯苓類藥材中茯苓三萜類化合物的藥物代謝動力學研究.pdf

1、茯苓類藥材來源于多孔菌科真菌茯苓（Poria cocos(Schw.) Wolf）的干燥菌核。根據(jù)入藥部位和功效不同，常分為茯苓皮、赤茯苓、茯苓、茯神四種。茯苓皮是茯苓菌核的外皮部分，有利水消腫之功效；赤茯苓為茯苓菌核近外表皮部淡紅色部分，有行水利濕熱、益心潤肺之功效；茯苓為菌核中間白色部分，有利水滲濕、益脾和胃之功效；茯神為菌核中心抱有松根部分，有寧心、安神、利水之功效。隨著茯苓皮、赤茯苓、茯苓、茯神入藥部位由表及里，其行水利尿作用逐

2、漸減弱而寧心安神作用增強。化學成分研究表明茯苓三萜類化合物是茯苓類藥材的主要活性物質(zhì)，種類多樣。
　　目前為止，茯苓不同藥用部位的茯苓三萜類化合物在體內(nèi)的藥物代謝動力學差異尚無系統(tǒng)研究，因此尚不明確造成茯苓類藥材功效之間差異的具體化學成分和作用機制。本研究利用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，建立一個可同時定量分析大鼠血漿中多種茯苓三萜類化合物的方法，應用于比較茯苓類藥材在大鼠體內(nèi)藥物動力學方面的差異，并發(fā)現(xiàn)和鑒定茯苓皮提取

3、液在大鼠體內(nèi)的代謝物，推測可能的代謝途徑。
　　第一部分：茯苓類藥材中茯苓三萜類化合物的藥物動力學比較
　　目的：建立生物樣品中茯苓類藥材8種茯苓三萜類化合物的UHPLC-Q-TOF-MS/MS定量測定方法，研究茯苓類藥材在大鼠體內(nèi)的藥物動力學特征，初步探討其藥物動力學的差異。
　　方法：
　　1.茯神、茯苓、赤茯苓、茯苓皮灌胃液的制備：將茯神、茯苓、赤茯苓、茯苓皮用90％乙醇加熱回流提取，提取液過濾，減壓除醇，

4、加適量水溶解，分別制備成茯神灌胃液（相當于2.5 g/mL原藥材）、茯苓灌胃液（相當于2.5 g/mL原藥材）、赤茯苓灌胃液（相當于2.0 g/mL原藥材）、茯苓皮灌胃液（相當于2.0 g/mL原藥材）。
　　2.生物樣品的采集和預處理：取24只250±30 g的雄性Sprague-Dawley大鼠，隨機分為4組，按體重以生藥材25 g/kg的給藥量，分別灌胃給予上述4種溶液。茯神、茯苓、茯苓皮分別于給藥后5 min，10 min

5、，30 min，1 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h，36 h，48 h；赤茯苓于給藥后10 min，30 min，1 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h，36 h，48 h，72 h眼內(nèi)眥靜脈叢取血，采用乙腈沉蛋白的方法處理血漿樣品。
　　3.樣品分析條件：采用 UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)。ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×100 mm，5μm）色譜柱。流動相為0.5‰甲酸-

6、0.5 mM乙酸銨水溶液和乙腈。ESI電離，子離子掃描模式，在負離子模式下檢測茯苓新酸B、去氫土莫酸、茯苓新酸A、豬苓酸C、茯苓新酸AM、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸、常春藤皂苷元。采用高分辨的單個子離子計算峰面積，并采用內(nèi)標法加權(quán)（1/x2）一元線性回歸定量。
　　4.藥物動力學研究與分析：根據(jù)測定結(jié)果，繪制藥時曲線，采用DAS3.0非房室模型計算藥物動力學參數(shù)，并比較4種藥材給藥的藥物動力學差異。
　　結(jié)果：大鼠血漿中茯

7、苓新酸B、去氫土莫酸、茯苓新酸A、豬苓酸C、茯苓新酸AM、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸在測定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.9930）。批內(nèi)、批間精密度的相對標準偏差（RSD）均小于10.3%，相對誤差（RE）為-6.1%~7.7%。基質(zhì)效應于91.4%~112.3%范圍內(nèi)，平均提取回收率為72.6%~102.6%。茯苓新酸AM在各組中均無吸收，茯苓新酸B、去氫土莫酸、茯苓新酸A、豬苓酸C、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸在茯苓皮組中吸收量

8、最大。
　　結(jié)論：本方法快速、靈敏、專屬、穩(wěn)定，可以用于茯苓類藥材在體內(nèi)成分的測定，為研究茯苓類藥材藥理作用機制提供了依據(jù)。
　　第二部分：茯苓皮在大鼠體內(nèi)吸收組分和代謝物的鑒定
　　目的：采用 UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，結(jié)合 Peakview和MetabolitePilot數(shù)據(jù)分析軟件，分析鑒定茯苓皮在大鼠血漿、膽汁和尿液中的吸收組分和代謝物，探索其活性成分在體內(nèi)的代謝途徑。
　　方法：
　

9、　1.茯苓皮灌胃液的制備：將茯苓皮用90%乙醇加熱回流提取，提取液過濾，減壓除醇，用水稀釋至相當于2.0 g/mL的原藥材。
　　2.生物樣品的采集和預處理：取12只雄性Sprague-Dawley大鼠，體重250±30 g，隨機分為4組，每組3只，按體重以25 g/kg的給藥量灌胃給予大鼠，分別采集給藥后1、2、4、8、12、24和36 h時的血漿樣品，24 h的膽汁樣品和72 h的尿液，分別合并所有的血漿、膽汁樣品和尿樣。將合

10、并的生物樣品分別用3倍量的乙酸乙酯萃取，萃取3次，每次15 min。合并乙酸乙酯層，減壓干燥，殘渣用甲醇溶解。
　　3.樣品分析條件：采用 UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析樣品。色譜柱為Phenomenex Luna3μ C18（2）100A（150×2.0 mm），流動相為2 mmol/L的乙酸銨-0.1%甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脫；高分辨質(zhì)譜采用ESI源，負離子模式，全掃描采集，采用動態(tài)背景扣除和信息依賴采集觸發(fā)二級

11、碎片的采集，每一循環(huán)采集8個最強峰的二級質(zhì)譜圖。
　　4.代謝物發(fā)現(xiàn)和鑒定的步驟：首先結(jié)合文獻，建立茯苓皮中茯苓三萜類已知化合物的信息庫。然后用 Peakview2.0軟件尋找血漿中的吸收組分、膽汁和尿樣中的原型藥物。再將這些吸收組分按照結(jié)構(gòu)特點進行分類，選擇有對照品且吸收量較大的化合物作為母藥，用MetabolitePilot1.5軟件以母藥為模板進行分析，尋找生物樣品中主要代謝物。最后根據(jù)茯苓三萜類的裂解規(guī)律和化合物的極性，解

12、析代謝物的結(jié)構(gòu)，及其可能的代謝轉(zhuǎn)化途徑。
　　結(jié)果：通過Peakview2.0，在血漿中尋找到15種主要的吸收組分；按結(jié)構(gòu)將其分為4類，其中3類分別以茯苓酸、茯苓新酸A和去氫土莫酸為母藥；利用MetabolitePilot1.5軟件進行數(shù)據(jù)分析，尋找并初步鑒定其代謝物，共鑒定出102種成分，主要的代謝類型為甲基化、氧化、水解、氫化和葡萄糖醛酸結(jié)合等。
　　結(jié)論：本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，成功發(fā)現(xiàn)和鑒定