以hTERT為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)合成的新型二氫吡唑類化合物抑制人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721增殖的作用機(jī)制研究.pdf

1、人端粒酶是由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞單位(hTERT)、人端粒酶RNA(hTR)以及人端粒酶相關(guān)蛋白(hTP1)等部分組成。端粒酶自1994年被發(fā)現(xiàn)以來，由于其在負(fù)責(zé)維持染色體完整性、細(xì)胞永生化以及腫瘤發(fā)生發(fā)展方面的關(guān)鍵作用而被廣泛研究。因此，以端粒酶作為抗腫瘤藥物篩選的新靶點(diǎn)成為了當(dāng)下研究的熱點(diǎn)，人們雖已發(fā)現(xiàn)或者設(shè)計(jì)合成了具備一定作用的抑制劑，但由于直到2008年端粒酶的晶體結(jié)構(gòu)才被確認(rèn)，以hTERT為作用靶點(diǎn)的高選擇性和高效的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)

2、及其藥理學(xué)作用機(jī)制研究至今仍然很少有報(bào)道。因此，本課題組基于端粒酶hTERT蛋白的晶體結(jié)構(gòu)和潛在活性中心，初步建立了分子對(duì)接模型，虛擬篩選出了一些高活性的骨架結(jié)構(gòu)，并以此為骨架基礎(chǔ)設(shè)計(jì)合成了一系列小分子化合物。同時(shí)對(duì)這一系列合成的小分子化合物進(jìn)行抗癌活性篩選和藥理學(xué)機(jī)制研究。本課題的主要研究內(nèi)容如下：
　　1.目標(biāo)化合物設(shè)計(jì)與合成
　　基于端粒酶hTERT蛋白的晶體結(jié)構(gòu)和潛在活性中心，初步建立了該抑制劑的分子對(duì)接模型，虛擬篩

3、選出了一些高活性的骨架結(jié)構(gòu)的化合物，并通過藥物化學(xué)的方法合成出這一系列化合物。
　　2.檢測(cè)小分子化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞株增殖的影響
　　對(duì)設(shè)計(jì)合成的小分子化合物進(jìn)行抗癌活性篩選：在人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、人肝癌細(xì)胞株 HepG2、人胃癌細(xì)胞株 MGC-803以及人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7上進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這一系列化合物中化合物4a對(duì)SMMC-7721腫瘤細(xì)胞的增殖作用抑制效果最明顯。同時(shí)，通過流式細(xì)胞術(shù)觀察化合物4

4、a對(duì)SMMC-7721腫瘤細(xì)胞周期的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)化合物4a處理48 h后S期細(xì)胞數(shù)顯著增多，而在G0/G1期細(xì)胞顯著減少，這提示化合物4a是通過阻滯細(xì)胞于S期實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖作用的。
　　3.檢測(cè)化合物4a對(duì)端粒酶活性以及hTERT的作用
　　通過改良的 TRAP實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物4a對(duì)端粒酶活性亦表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，IC50值為7.81±1.32μM。同時(shí)通過

5、Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hTERT蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示用化合物4a處理細(xì)胞48 h后hTERT蛋白的表達(dá)量下降。提示化合物4a對(duì)hTERT蛋白以及端粒酶活性具有較強(qiáng)的抑制作用。
　　4.檢測(cè)化合物4a對(duì)NF-κb/P65信號(hào)通路的影響，檢測(cè)P65、IL-6以及TNF-α表達(dá)的變化
　　通過Q-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)化合物4a對(duì) SMMC-7721肝癌細(xì)胞中NF-κb信號(hào)通路中關(guān)鍵分子P65的蛋白

6、表達(dá)及其下游的信號(hào)分子如IL-6和TNF-αmRNA和蛋白的表達(dá)具有下調(diào)作用，這提示化合物4a抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖作用可能與NF-κb/P65信號(hào)通路有關(guān)。
　　5.過表達(dá)hTERT，檢測(cè)化合物4a對(duì)NF-κb/P65信號(hào)通路中P65、IL-6、TNF-α的影響。
　　Werstern blot以及Q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)組P65蛋白表達(dá)以及IL-6和TNF-αmRNA和蛋白的表達(dá)量明顯增多，用化合物4a處理

7、48 h后表達(dá)量明顯下降，這提示人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中隨著hTERT表達(dá)量的升高，P65蛋白表達(dá)以及IL-6和TNF-α mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)，同時(shí)化合物4a對(duì)P65蛋白表達(dá)以及IL-6和TNF-αmRNA和蛋白的表達(dá)水平具有明顯下調(diào)的作用。該結(jié)果進(jìn)一步提示通過作用于hTERT，化合物4a對(duì)下游NF-κb/P65信號(hào)通路產(chǎn)生作用從而抑制SMMC-7721肝癌細(xì)胞增殖。
　　綜上所述，本課題組以分子對(duì)接模型篩選

8、出的靶向hTERT的高活性骨架結(jié)構(gòu)——N-砜基-芳基二氫吡唑?yàn)榛A(chǔ)，設(shè)計(jì)、合成了一系列新型二氫吡唑類化合物，同時(shí)通過藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法篩選出了一個(gè)潛在的小分子抑制劑——化合物4a，并對(duì)其可能的藥理學(xué)作用機(jī)制進(jìn)一步研究探討。一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過靶向 hTERT抑制端粒酶活性，化合物4a將SMMC-7721肝癌細(xì)胞阻滯于S期，實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖的目的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)這種作用的實(shí)現(xiàn)可能和細(xì)胞增殖活化相關(guān)的 NF-κb/P65經(jīng)典信號(hào)通路的下調(diào)密切相關(guān)。