MOB2在肝癌細(xì)胞SMMC-7721的作用.pdf

1、本文從以下三部分進(jìn)行了研究：
　　 第一部分 MOB2在肝細(xì)胞癌的表達(dá)及其意義
　　 目的：研究原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(HCC)中MOB2的表達(dá)及其與HCC臨床病理特征關(guān)系。
　　 方法：采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)50例肝癌及其癌旁組織中MOB2蛋白表達(dá)情況，并分析其與肝細(xì)胞癌的臨床病理因素之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示50例肝癌組織中MOB2蛋白陽性表達(dá)率為40％，相對(duì)應(yīng)的癌旁組織MOB2的蛋白表達(dá)為

2、96％。肝癌組織中MOB2的表達(dá)明顯低于相應(yīng)的癌旁組織，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P<0.05)。MOB2在肝癌組織蛋白表達(dá)率明顯低于癌旁組織，(P<0.05)；MOB2蛋白在肝癌組織中的表達(dá)與性別、腫瘤大小、AFP水平、患者血清HBsAg是否陽性、Edmondson分級(jí)、有無門靜脈癌栓無關(guān)(P>0.05)。
　　 結(jié)論：MOB2蛋白缺失可能與肝癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移過程有關(guān)。MOB2有望成為一個(gè)新的分子指標(biāo)，可用于肝細(xì)胞

3、癌的診斷、治療和監(jiān)測(cè)患者的預(yù)后。
　　 第二部分 MOB2真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 目的：從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞提取總RNA，利用RT-PCR法反應(yīng)獲得目的基因MOB2的cDNA片段，構(gòu)建具備可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染和容易被識(shí)別篩選的pEGFP-Cl-MOB2質(zhì)粒載體。
　　 方法：應(yīng)用Trizol法從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中提取mRNA，按照GeneBank公布的MOB2基因序列設(shè)計(jì)引物：5’端引物：5，-CCCAAGCTTCCA

4、TGGACTGGCTCATGGGGAAGTC-3’；下游引物：5’-CGGGGTACCTCATCTCCTTCACGTGGTTCTG-3’。RT-PCR反應(yīng)獲得734bp大小的MOB2cDNA片段。MOB2和載體pEGFP-Cl用Hindlll、KpnI進(jìn)行雙酶切，二者進(jìn)行連接，構(gòu)建包含目的基因MOB2的重組質(zhì)粒pEGFP-Cl-MOB2。
　　 結(jié)果：使用Trizol法分離和提取得到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞提取總RNA，通過RT-PCR

5、法反應(yīng)獲得目的基因MOB2的cDNA片段，構(gòu)建完成了能夠穩(wěn)定表達(dá)和具有篩選特征的pEGFP-Cl-MOB2質(zhì)粒載體，供后續(xù)轉(zhuǎn)染和表達(dá)實(shí)驗(yàn)使用。
　　 結(jié)論：Trizol法簡(jiǎn)便快速提取到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞提取總RNA，RT-PCR法準(zhǔn)確地獲得目的基因MOB2的cDNA片段，正確構(gòu)建完成了pEGFP-Cl-MOB2質(zhì)粒載體
　　 第三部分重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染及其對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的生長的影響
　　 目的：對(duì)重組

6、pEGFP-Cl-MOB2質(zhì)粒載體進(jìn)行擴(kuò)增、純化，將重組載體轉(zhuǎn)染入肝癌SMMC-7721細(xì)胞中，篩選出陽性細(xì)胞克??；并研究轉(zhuǎn)染MOB2對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的生長和侵襲力是否會(huì)受到影響，是否會(huì)有顯著的細(xì)胞凋亡出現(xiàn)，探討MOB2是否會(huì)影響SMMC-7721的細(xì)胞周期進(jìn)展和分布比例，以判斷MOB2在肝細(xì)胞癌的發(fā)生和進(jìn)展方面是否扮演著關(guān)鍵性的作用。
　　 方法：采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)pEGFP-Cl-MOB

7、2在肝癌SMMC-7721細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并采用含G418的培養(yǎng)基篩選一獲得陽性克隆的整合了基因的MOB2基因的SMMC-7721細(xì)胞，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后MOB2蛋白量，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化，Transwell小室測(cè)定細(xì)胞的體外侵襲能力。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期變化情況。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體外成瘤實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染MOB2基因后肝癌SMMC-7721細(xì)胞的生長

8、增殖受到了顯著的抑制，說明轉(zhuǎn)染MOB2可以起到抑制肝癌細(xì)胞的過度增長；轉(zhuǎn)染MOB2基因后肝癌SMMC-7721細(xì)胞的侵襲能力顯著降低，說明轉(zhuǎn)染抑癌基因MOB2可以抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　 結(jié)論：重組質(zhì)粒pEGFP-Cl-MOB2成功轉(zhuǎn)染肝癌SMMC-7721細(xì)胞，篩選獲得包含MOB2的陽性克隆SMMC-7721細(xì)胞。轉(zhuǎn)染MOB2基因后SMMC-7721細(xì)胞生長增殖受到顯著的抑制、遷移能力下降，MOB2