喜樹堿誘導(dǎo)SMMC-7721肝癌細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、研究目的： 喜樹堿是從喜樹(珙桐科,喜樹屬)中提取出的五環(huán)生物堿,是拓撲異構(gòu)酶I抑制劑,能可逆性地與拓撲異構(gòu)酶I-DNA可裂解復(fù)合物結(jié)合。喜樹堿衍生物伊利替康和拓撲替康已廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的治療,尤其是肝癌?？闪呀獾腄NA-拓撲異構(gòu)酶-喜樹堿三元復(fù)合物一旦轉(zhuǎn)變成不可裂解復(fù)合物,將導(dǎo)致DNA損傷、DNA修復(fù)機制的激活,細胞周期調(diào)控蛋白的表達變化和細胞凋亡等一系列信號通路的改變。這些通路中關(guān)鍵調(diào)控分子的失活極大地影響了癌變過程,并與

2、拓撲異構(gòu)酶I抑制劑的作用密切相關(guān)。以多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)為例,該蛋白參與了DNA修復(fù)機制,對維持基因穩(wěn)定性有重要作用。喜樹堿可激活PARP的表達,PARP缺失或基因敲除的細胞很容易發(fā)生癌變,并且對喜樹堿的細胞毒作用高度敏感,同時PARP抑制劑亦可以增強喜樹堿衍生物的抗腫瘤作用。此外,喜樹堿誘導(dǎo)的細胞信號通路中,CHK1,CHK2和NF-κB等細胞周期阻滯和細胞凋亡相關(guān)的信號分子均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,這些功能蛋白的抑制

3、劑同樣可以強化喜樹堿的細胞毒性,并成為國內(nèi)外腫瘤研究的熱點和難點。因此,在模式體系中進一步研究喜樹堿作用后的關(guān)鍵調(diào)控因子,探索可靠、敏感的生物靶標,有助于完善腫瘤應(yīng)對細胞毒藥物作用的特異性調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為腫瘤治療奠定堅實的理論基礎(chǔ)。本實驗采用了雙向凝膠電泳的方法對喜樹堿誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細胞蛋白質(zhì)組的變化進行分離和分析,并對喜樹堿誘導(dǎo)半乳糖凝集素-1(Galectin-1)表達變化的調(diào)控機制作出了初步的探索。 半乳糖凝集素

4、-1是凝集素家族成員之一,廣泛參與了細胞生命活動,如調(diào)節(jié)細胞粘附和增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移、細胞凋亡、免疫逃逸和血管再生等。正常肝臟組織中,Galectin-1幾乎不表達,但是在肝癌細胞中往往過量表達。此外利用RNA干擾技術(shù)抑制Galectin-1的表達后,腫瘤細胞對細胞毒藥物SN-38(喜樹堿的衍生物)的敏感性得到大幅度增加,而加入重組的Galectin-1后,這種敏感性可以被部分抵消。有報道稱Galectin-1組織特異性表達與DNA甲基化模

5、式有關(guān),而且在去甲基化作用下,其表達可得到提高。而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)負責(zé)DNA復(fù)制過程中維持DNA的甲基化模式。因此,DNMTs是否參與了喜樹堿對Galectin-1的表達調(diào)控,并影響喜樹堿誘導(dǎo)的增殖抑制和細胞凋亡值得進一步研究。 研究方法： 喜樹堿(55μg/ml)處理SMMC-7721肝癌細胞6小時后,收集喜樹堿處理組和空白對照組的細胞總蛋白質(zhì),行雙向凝膠電泳(2-D)。電泳圖譜經(jīng)圖像掃描分析后,選取了若

6、干個表達量大,并且有差異的蛋白質(zhì)點進行MALDI-TOF質(zhì)譜分析。采用熒光定量RT-PCR和Western Blot方法對2-D結(jié)果進行驗證,并檢測了喜樹堿對SMMC-7721細胞Galectin-1 mRNA和蛋白表達的影響。隨后應(yīng)用ELISA法,檢測了喜樹堿對SMMC-7721肝癌細胞DNMTs表達的影響。接著通過MTT實驗和流式細胞術(shù)分析,檢測了DNMTs抑制劑5-脫氧氮雜胞苷、喜樹堿單獨用藥或者聯(lián)合用藥對SMMC-7721細胞增

7、殖和凋亡的影響。最后檢測了低濃度5-脫氧氮雜胞苷對SMMC-7721細胞周期分布的影響情況。 結(jié)果： Galectin-1的分離和鑒定 喜樹堿處理SMMC-7721細胞6小時后,收集細胞總蛋白行雙向凝膠電泳(2-D),分析喜樹堿處理組和空白對照組的總蛋白質(zhì)的差異。在相同實驗條件下進行3次2-D,銀染顯色后得到喜樹堿處理組(實驗組)和對照組SMMC-7721細胞蛋白質(zhì)的2-D圖譜。PDQuest軟件分析顯示,實驗組

8、蛋白質(zhì)點數(shù)為761±56個,對照組為731±80個,兩塊平均膠的匹配率分別為70％,61％。比較兩組細胞平均膠的差異(差異2倍以上認為有差異),有317個蛋白僅在實驗組細胞中出現(xiàn),有30個蛋白僅在對照組細胞中出現(xiàn)；有386個蛋白點在兩組細胞中均存在,其中在實驗組中表達量顯著高于對照組的蛋白質(zhì)點有37個；在對照組中表達量高于實驗組的蛋白質(zhì)點有29個。質(zhì)譜結(jié)果顯示,喜樹堿誘導(dǎo)的某個表達下降的蛋白為Galectin-1。 Galect

9、in-1表達的檢測 本實驗運用了實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR和Western免疫雜交技術(shù),測定了喜樹堿刺激后Galectin-1在mRNA和蛋白水平上的表達變化。結(jié)果顯示喜樹堿(55μg/ml)刺激SMMC-7721細胞6 h后,Galectin-1的mRNA和蛋白表達顯著下降(P<0.05),與比較蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。 喜樹堿下調(diào)DNMTs的表達 蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),喜樹堿可調(diào)控SMMC-7721肝癌細胞Galec

10、tin-1的表達變化,但是其具體調(diào)控機制尚不明確。據(jù)報道,Galectin-1基因啟動子附近區(qū)域富含GC區(qū),DNA甲基化是該基因表達重要的調(diào)控機制。因此DNA甲基化機制是否參與了喜樹堿誘導(dǎo)的信號通路,并影響Galectin-1的表達值得進一步研究。ELISA法檢測了喜樹堿(55μg/ml)對SMMC-7721肝癌細胞DNMTs表達的影響。結(jié)果顯示,喜樹堿顯著性地抑制DNMTs的表達(P<0.05),抑制程度隨著時間延長而增加,并且呈時間

11、依賴性。 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑增強了喜樹堿的細胞增殖抑制和促凋亡作用 5-脫氧氮雜胞苷(DAC)是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。體外研究證實,它通過去甲基化作用能使多種CpG島過甲基化的抑癌基因重新表達,而恢復(fù)抑癌功能。喜樹堿顯著性地抑制DNMTs的表達,提示喜樹堿的作用機制與DNA甲基化有關(guān),因此本部分實驗檢測了5-脫氧氮雜胞苷、喜樹堿單獨用藥或者聯(lián)合用藥對SMMC-7721細胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果表明,低濃度(0.

12、0228μg/ml)5-脫氧氮雜胞苷并不影響SMMC-7721細胞增殖和凋亡,而同樣濃度喜樹堿對低濃度5-脫氧氮雜胞苷預(yù)處理的SMMC-7721細胞的增殖抑制和促凋亡的作用明顯高于喜樹堿單獨作用組(P<0.05)。 5-脫氧氮雜胞苷增強喜樹堿細胞增殖抑制和促凋亡作用與細胞周期分布無關(guān) 喜樹堿是細胞周期特異性藥物,主要作用于細胞S期。大量研究表明,5-脫氧氮雜胞苷影響細胞周期分布,造成細胞周期的阻滯,S期和G2/M期的聚集

13、。因此5-脫氧氮雜胞苷增強喜樹堿細胞增殖抑制和促凋亡作用可能與細胞周期分布的改變有關(guān)。本實驗檢測了5-脫氧氮雜胞苷(0.0228μg/ml)對SMMC-7721細胞周期分布的影響。結(jié)果顯示,低濃度5-脫氧氮雜胞苷并未影響SMMC-7721細胞的周期分布。 結(jié)論： 本實驗建立了一套分辨率高、重復(fù)性好的蛋白質(zhì)組學(xué)方法,并證明了該方法在尋找喜樹堿誘導(dǎo)的相關(guān)下游信號蛋白的有效性和可行性,提供了SMMC-7721肝癌細胞蛋白質(zhì)的雙

14、向電泳圖譜,比較和分析了喜樹堿誘導(dǎo)SMMC-7721細胞后蛋白質(zhì)點的差異,并對差異蛋白進行了質(zhì)譜鑒定。 本實驗發(fā)現(xiàn)喜樹堿的分子作用機制中新的下游蛋白,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,并且提示喜樹堿抑制DNMTs的活性,是喜樹堿的分子藥理作用新的重要環(huán)節(jié)。在抑制細胞的增殖和促進細胞凋亡的作用方面,DNMTs抑制劑5-脫氧氮雜胞苷和喜樹堿聯(lián)合用藥組的效果明顯高于喜樹堿單獨用藥組,提示5-脫氧氮雜胞苷預(yù)處理可以強化喜樹堿對肝癌細胞的細胞毒作用,為肝