白英醇提物誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡機(jī)制研究.pdf

1、目的:白英(solanum lyratum thumb SLT)為傳統(tǒng)中藥已有2000多年的歷史,具有清熱利濕、消腫解毒之功效,是常用的抗癌中草藥,臨床上多用于肝癌、腦癌、肺癌、宮頸癌、胃癌、鼻咽癌、聲帶癌、食管癌、胰腺癌、腎癌、腎盂癌、膀胱癌、前列腺癌、絨毛膜上皮癌等多種癌癥的治療。迄今為止,白英的抗腫瘤作用機(jī)制及其活性成分尚未完全明確,而且對(duì)白英抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面的研究,國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究探討白英醇提物抑

2、制肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖效應(yīng)和誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡及其分子機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:1.取白英干品50克,攪碎,采用浸漬法,抽濾,濃縮獲取白英醇提物。
　　 2.體外培養(yǎng)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為正常對(duì)照組、白英醇提物處理組(濃度分別為5、10、20mg/ml)和陽(yáng)性對(duì)照組(順鉑,濃度為20 mg/L)。
　　 3.采用四唑鹽(MTT法)檢測(cè)人肝癌SMMC-77

3、21細(xì)胞存活和生長(zhǎng),繪制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(MTT法)。
　　 4.白英醇提物分別作用人肝癌SMMC-7721細(xì)胞24h、48h、72h和96h后,采用細(xì)胞毒(MTT法)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞抑制率和IC50值。
　　 5.白英醇提物作用人肝癌SMMC-7721細(xì)胞48h后,采用熒光顯微鏡觀察人肝癌SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)變化。
　　 6.白英醇提物作用人肝癌SMMC-7721細(xì)胞48h后,流式細(xì)胞

4、儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期變化。
　　 7.白英醇提物作用人肝癌SMMC-7721細(xì)胞48h后,半定量RT-PCR測(cè)定基因bcl-2、bax、caspase-9、caspase-3的表達(dá)變化。
　　 8.白英醇提物作用人肝癌SMMC-7721細(xì)胞48h后,測(cè)定caspase-3活性。
　　 結(jié)果:1.人肝癌SMMC-7721細(xì)胞在細(xì)胞接種后的第2-6天出現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,第7天細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始下降。
　　 2.白

5、英醇提取物對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的抑制作用,且這種作用呈一定的劑量和時(shí)間依賴性。5、10、20mg/ml SLT和DDP處理24h細(xì)胞抑制率分別為(17.365±0.535)％、(35.705±0.958)％、(51.876±1.684)％和(75.855±2.536)％,處理48 h細(xì)胞抑制率分別為(28.551±0.715)％、(47.106±1.386)％、(61.078±2.486)％和(85.105±1.34

6、9)％,處理72h細(xì)胞抑制率分別為(39.854±0.723)％、(58.213±1.479)％、(72.131±2.340)％和(92.258±2.514)％,處理96 h的細(xì)胞抑制率分別為(49.895±0.857)％、(65.354±2.158)％、(77.652±2.317)％和(97.358±2.957)％以上各組細(xì)胞抑制率與正常對(duì)照組比較均有顯著差異(p<0.01)；白英醇提取物處理24h、48 h、72h和96 h的IC5

7、0分別為19.19、12.42、7.90和5.48mg/ml。
　　 3.觀察到細(xì)胞凋亡所特有的典型形態(tài)特征。形態(tài)學(xué)觀察可見(jiàn)細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)凝集邊聚、核斷裂,凋亡小體等特征。
　　 4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)5,10,20 mg/ml SLT醇提物、DDP處理組人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡率分別為(18.26±1.25)％、(26.24±3.12)％、(39.08±2.49)％,(58.25±5.56)％與正常

8、對(duì)照組凋亡率(3.25±0.56)％比較均有顯著差異(p<0.01)。G0/G1細(xì)胞比率分別為(36.35±6.20)％、(50.11±4.04)％、(59.23±1.68)％和(32.65±3.63)％,顯著高于正常對(duì)照組(27.94±4.35)％(P<0.05或P<0.01)。
　　 5.半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,bcl-2mRNA表達(dá)下調(diào)而bax、caspase-9和caspase-3 mRNA表達(dá)上調(diào)。5、10、2

9、0 mg/ml SLT處理組bcl-2/β-actin光密度積分值之比分別為0.42±0.04、0.23±0.04、0.12±0.03與正常對(duì)照組0.62±0.04相比有顯著差異(p<0.01)；bax/β-actin光密度積分值之比分別為0.35±0.04、0.56±0.05、0.72±0.05與正常對(duì)照組0.23±0.02相比有顯著差異(p<0.05或P<0.01)；caspase-9/β-actin光密度積分值之比分別為0.46±

10、0.02、0.55±0.03、0.73±0.03與正常對(duì)照組0.19±0.02相比有顯著差異(p<0.01)。caspase-3/β-actin光密度積分值之比分別為0.35±0.02、0.55±0.03、0.68±0.03與正常對(duì)照組0.22±0.02相比有顯著差異(p<0.01)。
　　 6.caspase-3活性測(cè)定提示白英醇提物對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡過(guò)程中caspase-3活性水平升高有一定的影響,三個(gè)不同濃度

11、(5mg/ml、10mg/ml和20 mg/ml)白英醇提取物作用肝癌SMMC-7721細(xì)胞48h后,caspaes-3活性分別是0.72±0.08；0.88±0.10和1.25±0.10,均顯著高于對(duì)照組(0.35±0.03)(P<0.01)。
　　 結(jié)論:白英醇提取物對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的抑制作用,且這種作用呈一定的劑量和時(shí)間依賴性。
　　 1.白英醇提取物具有誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡作用,