rmhTNF-α聯(lián)合DDP對肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖、凋亡的影響.pdf

1、目的：通過研究重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子-α(recombinant mutant human tumor necrosis factor α，rmhTNF-α)對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的體外作用，觀察rmhTNF-α聯(lián)合抗癌藥物順鉑(cisplatin，DDP)對SMMC-7721細(xì)胞體外作用的影響，進(jìn)一步闡明rmhTNF-α增加DDP抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的可能機制。 方法： 1.體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞SMMC-7

2、721，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(tetezolium-based colorimetric assay, MTT)比色法檢測rmhTNF-α、DDP及兩者聯(lián)合對該細(xì)胞增殖的影響。 2流式細(xì)胞儀測定兩者聯(lián)合對SMMC-7721細(xì)胞周期分布和凋亡的影響。 3根據(jù)MTT的結(jié)果，設(shè)置對照組(單細(xì)胞懸液組)及實驗組，分別提取各組細(xì)胞總RNA，鑒定其完整性及含量，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(revers transcription PCR

3、，RT-PCR)定量檢測各處理組處理前后SMMC-7721細(xì)胞中存活素(survivin mRNA)的表達(dá)水平。 4采用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)半定量檢測rmhTNF-α聯(lián)合DDP處理細(xì)胞48h后缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)蛋白的表達(dá)水平。 5根據(jù)MTT結(jié)果，采用isobolanalysis公式分析相互作用指數(shù)(Iteraction Index)，評價聯(lián)合后的作用，如相互作用指數(shù)>1為兩藥拮抗

4、作用；相互作用指數(shù)=1為兩藥相加作用；相互作用指數(shù)<1為兩藥協(xié)同作用。 結(jié)果： 1.MTT比色法顯示rmhTNF-α、DDP及兩者聯(lián)合對SMMC-7721細(xì)胞增殖均具有抑制作用。不同濃度rmhTNF-α(0～1600iu/ml)、DDP(0～10 μg/ml)處理細(xì)胞48h后，與對照組相比，各組OD值均有不同程度下降，差異具有極顯著性(P<0.01)。各組之間差異亦具有極顯著性(P<0.01)。且兩種藥物處理SMMC-7

5、721細(xì)胞均隨藥物濃度的增大，對細(xì)胞的抑制率逐漸增強，即兩種藥物對SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用呈明顯的劑量依賴效應(yīng)。MTT比色法分析rmhTNF-α聯(lián)合DDP對SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用，顯示：400iu/ml、1600iu/ml的rmhTNF-α均可加強DDP對SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用，且隨rmhTNF-α濃度的增大，其對DDP的協(xié)同作用增強。單用DDP的IC50為4.018μg/ml，聯(lián)合rmhTNF-

6、α(400iu/ml)后可將DDP的IC50降低至2.658μg/ml；聯(lián)合rmhTNF-α(1600 iu/ml)后可將DDP的IC50降低至1.621μg/ml，因此，rmhTNF-α可加強DDP對SMMC-7721細(xì)胞增殖抑制作用。 2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布顯示，各處理組作用SMMC-7721細(xì)胞48h后，G0/G1期細(xì)胞變化不明顯，S期細(xì)胞逐漸減少，G2/M期細(xì)胞逐漸增多。即rmhTNF-α及二者聯(lián)合作用于SMMC-

7、7721細(xì)胞均可阻滯SMMC-7721細(xì)胞周期進(jìn)程于G2/M期。各處理組處理細(xì)胞48h后，流式細(xì)胞儀可測得典型的亞二倍凋亡峰，對照組、rmhTNF-α(400iu/ml)組、rmhTNF-α(1600iu/ml)組、DDP(2.0μg/ml)組、rmhTNF-α(400iu/ml)+DDP(2.0 μg/ml)組、rmhTNF-α(1600iu/ml)+DDP(2.0 μg/ml)組分別處理SMMC-7721細(xì)胞48h后，凋亡百分率分別

8、為2.32％、6.59％、9.25％、8.13％、16.47％、27.94％。除單獨應(yīng)用rmhTNF-α(400iu/ml)組與對照組比較差異不明顯，其他各處理組與對照組比較均有顯著差異(P＜0.05)。 3半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示：rmhTNF-α單獨用藥組、DDP組及兩者聯(lián)合組處理SMMC-7721細(xì)胞48h后，survivin mRNA有不同程度的降低，rmhTNF-α(1600iu/ml)聯(lián)合DDP組作用48h后對

9、SMMC-7721細(xì)胞survivin mRNA表達(dá)抑制最顯著。4流式細(xì)胞儀間接分析細(xì)胞HIF-1蛋白表達(dá)顯示，對照組、rmhTNF-α(400iu/ml)組、rmhTNF-α(1600iu/ml)組、DDP(2.0μg/ml)組、rmhTNF-α(400iu/ml)+DDP(2.0μg/ml)組、rmhTNF-(1600iu/ml)+DDP(2.0 μg/ml)組處理SMMC-7721細(xì)胞48h后，HIF-1的熒光指數(shù)FI值較對照組均

10、減小。比較各處理組和對照組的FI值及聯(lián)合用藥組與單獨使用DDP組的FI值，除單獨使用rmhTNF-α(400iu/ml)組及DDP組HIF-1蛋白的FI值與對照組無顯著差異，其他各組差異均具有顯著性(P＜0.05)。 5.Isobolanalysis分析相互作用指數(shù)顯示，rmhTNF-α聯(lián)合DDP在細(xì)胞生長抑制率為50％時的相互作用指數(shù)為0.74，證明rmhTNF-α確實可協(xié)同DDP對SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用。

11、 結(jié)論： 1本試驗證實在一定濃度范圍內(nèi)，rmhTNF-α能夠抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖，并呈劑量依賴關(guān)系。 2.rmhTNF-α可增強DDP對SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用。 3.rmhTNF-α及其聯(lián)合DDP可阻滯肝癌SMMC-7721細(xì)胞于G2/M期并可誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡。 4.rmhTNF-α增強DDP誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的作用的機制，可能與下調(diào)survivin、HIF-1蛋白的表