復(fù)方斑蝥膠囊血清誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞蛋白質(zhì)組差異表達(dá)分析.pdf

1、目的：復(fù)方斑蝥膠囊是根據(jù)衛(wèi)生部頒布的標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)的純中藥膠囊制劑，臨床上以治療原發(fā)性肝癌為主，療效較好，但其作用機(jī)制卻不甚明了。本研究運(yùn)用中藥血清藥理學(xué)結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)方法，分析復(fù)方斑蝥膠囊血清誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)，有助于從整體水平監(jiān)測藥物作用下蛋白質(zhì)分子的變化規(guī)律，尋找出可能介導(dǎo)復(fù)方斑蝥膠囊作用的生物分子、作用靶點(diǎn)，從分子細(xì)胞水平推測該藥的可能作用機(jī)制。 方法：1．制備復(fù)方斑蝥膠囊血清和對照血清并處

2、理肝癌SMMC-7721細(xì)胞72h后收集細(xì)胞裂解提取蛋白質(zhì)。 2．用雙向凝膠電泳(2-dimensionalgelelectrophoresis，2-DE)分別分離藥物處理細(xì)胞和對照細(xì)胞蛋白質(zhì)，采用寬范圍(pH3-10L)結(jié)合窄范圍(pH4-7L)的IPG膠條進(jìn)行分離，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后用PDQuest軟件進(jìn)行圖像分析。 3．對差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)用胰酶進(jìn)行膠內(nèi)酶切，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS

3、)分析酶切片斷，得到肽質(zhì)量指紋圖(PMF)，使用國際互聯(lián)網(wǎng)上MatrixScience公司提供的PMF鑒定程序(Mascot：PeptideMassFingerprint)進(jìn)行查詢鑒定。 結(jié)果：1．寬范圍的IPG膠條(pH3-10L)比較復(fù)方斑蝥膠囊血清處理細(xì)胞和對照細(xì)胞蛋白質(zhì)2-DE圖譜顯示，蛋白質(zhì)主要集中在相對分子質(zhì)量(Mr)范圍在14.4-75kDa內(nèi)，等電點(diǎn)(pI)主要分布在pH4.0-8.0之間。PDQuest軟件分析

4、圖像，檢測到pH3-10L膠條分離處理細(xì)胞和對照細(xì)胞的蛋白點(diǎn)約為450個，兩倍以上顯著性量變的點(diǎn)有47個，且差異蛋白點(diǎn)主要集中在pH4-7的范圍內(nèi)，對照蛋白和處理細(xì)胞蛋白圖譜之間的匹配率為72％。窄范圍的IPG膠條(pH4-7L)電泳圖譜顯示大約570個點(diǎn)，兩倍以上量變的蛋白點(diǎn)有53個。對照蛋白和處理細(xì)胞蛋白圖譜間的匹配率為79％。 2．對13個差異候選蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定，經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢，4個蛋白點(diǎn)獲得了有意義

5、的結(jié)果(p＜0.05)，分別為70kDa熱休克蛋白(Heatshock70kDaprotein8，)、膜聯(lián)蛋白A5(AnnexinA5，ANXA5)、真核翻譯起始因子5A(Eukaryotictranslationinitiationfactor5A，eIF-5A)和硫氧還蛋白過氧化酶2(Peroxiredoxin-2，PRDX2)。其中ANXA5和HSP70在藥物處理細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，另外兩種蛋白表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論：1．中藥抗癌是

6、一個涉及多成分、多靶點(diǎn)、多因素參與的復(fù)雜過程，在復(fù)方斑蝥膠囊抵抗人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞的過程中既有下調(diào)抗凋亡蛋白PRDX2的合成來抑制抗凋亡作用，也有下調(diào)eIF-5A導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯而促進(jìn)凋亡，和上調(diào)annexinV以促進(jìn)抗增殖作用及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥及上調(diào)HSP70促進(jìn)抗腫瘤免疫等多種機(jī)制的共同參與。 2．HSP70細(xì)胞外HSP70是一種強(qiáng)效的腫瘤免疫治療因子，它能對抗腫瘤抗原耐受性，導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞的特異性腫瘤細(xì)胞殺傷

7、效應(yīng)，高表達(dá)的HSP70能夠阻止促炎癥反應(yīng)抗凋亡因子——NF-kappa-B的活化和核轉(zhuǎn)運(yùn)而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，HSP70表達(dá)上調(diào)有可能促進(jìn)其它聯(lián)用藥物的抗腫瘤免疫反應(yīng)。 3．活性eIF-5A是維持哺乳動物細(xì)胞、酵母和古細(xì)菌生長的必要因子，活性eIF-5A參與調(diào)控細(xì)胞G(1)-S轉(zhuǎn)化的蛋白表達(dá)過程。它的下調(diào)可導(dǎo)致極強(qiáng)的抗增殖效應(yīng)，使哺乳動物細(xì)胞包括多種癌細(xì)胞系在內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯。 4．ANXA5是蛋白激酶C和磷脂酶A2的內(nèi)