DHA調(diào)控人肝癌細胞SMMC-7721上皮間質(zhì)轉化(EMT)的分子機制研究.pdf

1、肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤,具有發(fā)病隱匿、惡性程度高、進展快、侵襲轉移性強、預后差等特點。手術切除是HCC治療的主要手段,但術后復發(fā)及轉移極大影響了肝癌治療后的遠期療效。近期研究顯示n-3多不飽和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids,PUFAs)能夠抑制腫瘤的發(fā)生和轉移,增強腫瘤細胞的藥物敏感性,然而機制尚不清楚。
　　二十二

2、碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)是深海魚油和海洋微藻中存在的n-3 PUFAs,是生物體的重要組成成分,其具有抗炎、防治心血管疾病、緩解各種代謝性疾病及抗腫瘤作用。研究指出,DHA通過脂質(zhì)過氧化和氧化應激,提高腫瘤細胞的細胞毒作用,還可以通過刺激產(chǎn)生線粒體ROS,使腫瘤細胞自噬。
　　上皮間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指具有極性的上皮細胞失去細胞

3、間粘附能力轉變成具有侵襲和遷移能力的間質(zhì)細胞的過程,是腫瘤轉移的重要機制之一。EMT過程中,細胞形態(tài)由鋪路石形轉變?yōu)橛星忠u性的長梭紡錘形,同時伴有其上皮標志蛋白下調(diào)（E-cadherin、α-catenin),間質(zhì)標志蛋白上調(diào)(N-cadherin、vimentin、fibronectin)。多種自分泌因子、轉錄因子、microRNAs以及TGF-β、Wnt/β-catenin、Notch等通路作為重要因素影響EMT。近期研究表明CD1

4、47也參與了HCC中EMT的發(fā)生。
　　CD147是一種高度糖基化的細胞膜糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族類黏附分子,該分子高表達于上皮來源的腫瘤細胞中,參與腫瘤細胞的侵襲和轉移過程。CD147的過表達可促進腫瘤細胞本身及其周圍的成纖維細胞和內(nèi)皮細胞分泌 MMPs降解細胞外基質(zhì),也可誘導HCC中EMT的發(fā)生促進腫瘤細胞侵襲。
　　本課題的研究目的:DHA對細胞增殖和凋亡的影響;DHA是否逆轉SMMC-7721細胞 EMT; DH

5、A是否通過逆轉 EMT抑制細胞的遷移和侵襲;明確CD147在DHA逆轉EMT中的作用。
　　第一部分:DHA對SMMC-7721細胞增殖和凋亡的影響
　　不同濃度DHA(0、10、20、50、100、200、300、400μM)分別干預SMMC-7721細胞24、48、72h后,用MTT法測定DHA對細胞存活能力的影響;流式細胞術檢測細胞凋亡情況。
　　1.在DHA濃度≤100μM范圍內(nèi),作用時間為48h時,100μM

6、組與陰性對照組相比,明顯抑制細胞增殖,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。此作用條件范圍內(nèi)的其它實驗組與陰性對照組相比,細胞存活率均無顯著性影響;當 DHA作用濃度≥200μM且作用24、48、72h后,實驗組與陰性對照組相比,細胞存活率顯著降低(P<0.05)。
　　2.DHA(0、20、50、100、200μM)作用SMMC-7721細胞48h后,其凋亡比例隨DHA作用濃度的增大而增加(P<0.05)。
　　結論:低濃度D

7、HA短時間作用細胞無明顯抑增殖作用,而高濃度DHA長時間作用后,能顯著抑制SMMC-7721細胞存活率并誘導其凋亡。
　　第二部分:DHA對SMMC-7721細胞EMT的影響
　　不同濃度DHA分別干預SMMC-7721細胞8、16、24、48h后,鏡下觀察細胞形態(tài)學的改變;利用Western Blot法檢測EMT標志蛋白(E-cadherin和N-cadherin)的表達。
　　1.鏡下觀察細胞形態(tài)由長梭形或紡錘形轉

8、變?yōu)橐?guī)則的鋪路石樣,呈現(xiàn)逆轉EMT的形態(tài)變化
　　2.實驗組與對照組相比,細胞經(jīng)DHA處理8、16h后,E-cadherin的表達量隨DHA作用濃度和時間的增加而增多。
　　3.DHA分別作用細胞8、16、24、48h后,N-cadherin的表達量隨DHA作用劑量的升高而降低。
　　結論:DHA能夠逆轉SMMC-7721細胞的EMT過程。
　　第三部分:DHA對SMMC-7721細胞遷移和侵襲能力的影響

9、　　不同濃度DHA分別干預SMMC-7721細胞24、48、72h后,劃痕實驗評價DHA對細胞遷移能力的影響;Transwell實驗評價DHA對細胞侵襲能力的影響。
　　1.同一時間點,不同濃度組(20、50、100、200μM)分別與對照組比較,細胞遷移率顯著降低(P<0.05),遷移率隨DHA濃度的增大而減小。
　　2.同一時間點,不同濃度組(20、50、100、200μM)的細胞侵襲能力與對照組相比顯著降低(P<0.0

10、5),細胞侵襲數(shù)量隨DHA濃度的增大而減少。
　　結論:DHA通過逆轉SMMC-7721細胞EMT過程顯著抑制其遷移和侵襲能力。
　　第四部分:DHA調(diào)控SMMC-7721細胞EMT的機制
　　不同濃度DHA分別干預SMMC-7721細胞8、16、24、48h后,Western Blot法和Real-Time PCR分別檢測CD147及其mRNA水平。
　　1.在DHA作用SMMC-7721細胞8、16h后,CD

11、147蛋白表達無明顯差異,而作用24、48h后,CD147蛋白的表達量隨DHA作用時間的增加而降低,也隨DHA作用劑量的升高而降低。
　　2.Real-Time PCR檢測發(fā)現(xiàn),8h組50、100、200μM的CD147轉錄水平,16 h和24 h組20、50、100、200μM的CD147轉錄水平與對照組相比顯著降低(P<0.05)。
　　結論:DHA抑制CD147蛋白及其mRNA的表達,CD147可能是逆轉EMT的潛在分