DHA調(diào)控人肝癌細(xì)胞SMMC-7721上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的分子機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤,具有發(fā)病隱匿、惡性程度高、進(jìn)展快、侵襲轉(zhuǎn)移性強(qiáng)、預(yù)后差等特點(diǎn)。手術(shù)切除是HCC治療的主要手段,但術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移極大影響了肝癌治療后的遠(yuǎn)期療效。近期研究顯示n-3多不飽和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids,PUFAs)能夠抑制腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性,然而機(jī)制尚不清楚。
　　二十二

2、碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)是深海魚油和海洋微藻中存在的n-3 PUFAs,是生物體的重要組成成分,其具有抗炎、防治心血管疾病、緩解各種代謝性疾病及抗腫瘤作用。研究指出,DHA通過脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激,提高腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,還可以通過刺激產(chǎn)生線粒體ROS,使腫瘤細(xì)胞自噬。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指具有極性的上皮細(xì)胞失去細(xì)胞

3、間粘附能力轉(zhuǎn)變成具有侵襲和遷移能力的間質(zhì)細(xì)胞的過程,是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。EMT過程中,細(xì)胞形態(tài)由鋪路石形轉(zhuǎn)變?yōu)橛星忠u性的長(zhǎng)梭紡錘形,同時(shí)伴有其上皮標(biāo)志蛋白下調(diào)（E-cadherin、α-catenin),間質(zhì)標(biāo)志蛋白上調(diào)(N-cadherin、vimentin、fibronectin)。多種自分泌因子、轉(zhuǎn)錄因子、microRNAs以及TGF-β、Wnt/β-catenin、Notch等通路作為重要因素影響EMT。近期研究表明CD1

4、47也參與了HCC中EMT的發(fā)生。
　　CD147是一種高度糖基化的細(xì)胞膜糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族類黏附分子,該分子高表達(dá)于上皮來源的腫瘤細(xì)胞中,參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。CD147的過表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞本身及其周圍的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌 MMPs降解細(xì)胞外基質(zhì),也可誘導(dǎo)HCC中EMT的發(fā)生促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲。
　　本課題的研究目的:DHA對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響;DHA是否逆轉(zhuǎn)SMMC-7721細(xì)胞 EMT; DH

5、A是否通過逆轉(zhuǎn) EMT抑制細(xì)胞的遷移和侵襲;明確CD147在DHA逆轉(zhuǎn)EMT中的作用。
　　第一部分:DHA對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　不同濃度DHA(0、10、20、50、100、200、300、400μM)分別干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞24、48、72h后,用MTT法測(cè)定DHA對(duì)細(xì)胞存活能力的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　1.在DHA濃度≤100μM范圍內(nèi),作用時(shí)間為48h時(shí),100μM

6、組與陰性對(duì)照組相比,明顯抑制細(xì)胞增殖,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此作用條件范圍內(nèi)的其它實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比,細(xì)胞存活率均無顯著性影響;當(dāng) DHA作用濃度≥200μM且作用24、48、72h后,實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比,細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)。
　　2.DHA(0、20、50、100、200μM)作用SMMC-7721細(xì)胞48h后,其凋亡比例隨DHA作用濃度的增大而增加(P<0.05)。
　　結(jié)論:低濃度D

7、HA短時(shí)間作用細(xì)胞無明顯抑增殖作用,而高濃度DHA長(zhǎng)時(shí)間作用后,能顯著抑制SMMC-7721細(xì)胞存活率并誘導(dǎo)其凋亡。
　　第二部分:DHA對(duì)SMMC-7721細(xì)胞EMT的影響
　　不同濃度DHA分別干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞8、16、24、48h后,鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變;利用Western Blot法檢測(cè)EMT標(biāo)志蛋白(E-cadherin和N-cadherin)的表達(dá)。
　　1.鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形或紡錘形轉(zhuǎn)

8、變?yōu)橐?guī)則的鋪路石樣,呈現(xiàn)逆轉(zhuǎn)EMT的形態(tài)變化
　　2.實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,細(xì)胞經(jīng)DHA處理8、16h后,E-cadherin的表達(dá)量隨DHA作用濃度和時(shí)間的增加而增多。
　　3.DHA分別作用細(xì)胞8、16、24、48h后,N-cadherin的表達(dá)量隨DHA作用劑量的升高而降低。
　　結(jié)論:DHA能夠逆轉(zhuǎn)SMMC-7721細(xì)胞的EMT過程。
　　第三部分:DHA對(duì)SMMC-7721細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

9、　　不同濃度DHA分別干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞24、48、72h后,劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)DHA對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響;Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)DHA對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　1.同一時(shí)間點(diǎn),不同濃度組(20、50、100、200μM)分別與對(duì)照組比較,細(xì)胞遷移率顯著降低(P<0.05),遷移率隨DHA濃度的增大而減小。
　　2.同一時(shí)間點(diǎn),不同濃度組(20、50、100、200μM)的細(xì)胞侵襲能力與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.0

10、5),細(xì)胞侵襲數(shù)量隨DHA濃度的增大而減少。
　　結(jié)論:DHA通過逆轉(zhuǎn)SMMC-7721細(xì)胞EMT過程顯著抑制其遷移和侵襲能力。
　　第四部分:DHA調(diào)控SMMC-7721細(xì)胞EMT的機(jī)制
　　不同濃度DHA分別干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞8、16、24、48h后,Western Blot法和Real-Time PCR分別檢測(cè)CD147及其mRNA水平。
　　1.在DHA作用SMMC-7721細(xì)胞8、16h后,CD

11、147蛋白表達(dá)無明顯差異,而作用24、48h后,CD147蛋白的表達(dá)量隨DHA作用時(shí)間的增加而降低,也隨DHA作用劑量的升高而降低。
　　2.Real-Time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),8h組50、100、200μM的CD147轉(zhuǎn)錄水平,16 h和24 h組20、50、100、200μM的CD147轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)。
　　結(jié)論:DHA抑制CD147蛋白及其mRNA的表達(dá),CD147可能是逆轉(zhuǎn)EMT的潛在分