RUNX3對(duì)人胃癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)的影響分子機(jī)制研究.pdf

1、胃癌是目前人類最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其死亡率占腫瘤相關(guān)死亡率的第二位。在我國(guó)，胃癌發(fā)病率高，預(yù)后差，導(dǎo)致胃癌患者死亡的主要原因是術(shù)后發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，因此研究胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子及其分子機(jī)制具有重要的理論價(jià)值和臨床意義。
　　 惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，包括腫瘤細(xì)胞從原發(fā)性病灶處分離，侵入周?chē)M織，穿透基底膜進(jìn)入血管和淋巴管，滲出血管和淋巴管，重新形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)進(jìn)而增殖成新的轉(zhuǎn)移灶，在此過(guò)程中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(E

2、MT)和間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)變(MET)起到了關(guān)鍵的作用。EMT在胚胎發(fā)育過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)，后來(lái)在眾多腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)EMT的發(fā)生。EMT在正常胚胎發(fā)育過(guò)程中是受到時(shí)間和空間上嚴(yán)密調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程，但在腫瘤中EMT的失調(diào)導(dǎo)致了上皮細(xì)胞失去了應(yīng)有表型，獲得了間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而引起了腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，此過(guò)程中上皮標(biāo)志性分子鈣粘蛋白E-cadherin表達(dá)降低，間質(zhì)標(biāo)志性分子波形蛋白Vimentin表達(dá)上升。臨床上胃癌發(fā)展過(guò)程中極易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，

3、治療和預(yù)后情況極差，所以研究胃癌侵襲轉(zhuǎn)移及EMT的相關(guān)分子機(jī)制是診斷和治療胃癌的重要基礎(chǔ)。
　　 RUNX3是RUNX蛋白家族成員之一，RUNX3在胚胎發(fā)育過(guò)程中主要參與胃腸道的發(fā)育，神經(jīng)發(fā)生等活動(dòng)，近些年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)RUNX3表達(dá)異常與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Qing-LinLi等發(fā)現(xiàn)RUNX3可以通過(guò)對(duì)胃粘膜上皮細(xì)胞增殖的抑制，促進(jìn)胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的停滯來(lái)調(diào)控胃粘膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。臨床研究顯示:RUNX3也與胃癌的

4、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，但關(guān)于RUNX3影響胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制還不完全清楚，RUNX3能否通過(guò)調(diào)控EMT影響胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移目前還未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討了腫瘤抑制因子RUNX3對(duì)人胃癌細(xì)胞EMT的影響及分子調(diào)控機(jī)制。
　　 第一部分:RUNX3對(duì)人胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響
　　 目的:探討RUNX3對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC823及SGC7901侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　 方法:將RUNX3的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞SGC7901及B

5、GC82348h后，一部分細(xì)胞提RNA和蛋白，做QRT-PCR和Westernblotting。另一部分細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，小室預(yù)鋪matrigel膠，取五萬(wàn)個(gè)細(xì)胞加入Transwell小室的上層，下層加入NTH3T3細(xì)胞培養(yǎng)液，24小時(shí)后，移去上層未侵襲的細(xì)胞，穿過(guò)的細(xì)胞甲醇固定后結(jié)晶紫染色并細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　 結(jié)果:QRT-PCR和Westernblotting顯示在人胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901中RUNX3基因顯著高表達(dá)

6、，Transwell實(shí)驗(yàn)中RUNX3高表達(dá)組相對(duì)于對(duì)照組侵襲到下層的細(xì)胞數(shù)顯著性減少。
　　 結(jié)論:轉(zhuǎn)染后RUNX3真核表達(dá)質(zhì)粒成功高表達(dá)RUNX3蛋白。
　　 Transwell實(shí)驗(yàn)表明在胃癌細(xì)胞系中高表達(dá)RUNX3組相對(duì)于對(duì)照組可以明顯抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移性。
　　 第二部分:RUNX3對(duì)EMT相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控
　　 目的:探討RUNX3對(duì)EMT相關(guān)基因E-cadherin、Vimentin、Snai

7、l及Twist表達(dá)的影響。
　　 方法:將RUNX3的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA和提取蛋白，Westernblotting及RT-PCR、QRT-PCR檢測(cè)RUNX3對(duì)E-cadherin、Vimentin、Snail及Twist表達(dá)的影響，穩(wěn)定特異性siRNA干擾RUNX3的表達(dá)72小時(shí)后，檢測(cè)E-cadherin及Vimentin的表達(dá)。
　　 結(jié)果:RUNX3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC790

8、1后，Westernblotting顯示E-cadherin的蛋白水平有所升高，但不太明顯，Vimcntin的蛋白水平顯著降低。將RUNX3用siRNA干擾后，Vimentin的蛋白水平明顯升高，RT-PCR和QRT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Runx3對(duì)E-cadherin和Vimentin的RNA水平?jīng)]有顯著影響。高表達(dá)RUNX3后Snail和Twist等調(diào)控EMT的轉(zhuǎn)錄因子在蛋白和RNA水平上均沒(méi)有什么變化。
　　 結(jié)論:高表達(dá)R

9、UNX3只在蛋白水平上能夠輕微升高E-cadherin的表達(dá)，顯著抑制Vimentin的表達(dá)，沉默RUNX3后Vimentin顯著升高，但是RUNX3對(duì)EMT的調(diào)控作用與Snail和Twist等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控?zé)o關(guān)，并且是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用方式。
　　 第三部分:Runx3調(diào)控Vimentin基因表達(dá)的分子機(jī)制
　　 目的:探討RUNX3對(duì)Vimentin基因的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的分子機(jī)制
　　 方法:轉(zhuǎn)染RUN

10、X3表達(dá)質(zhì)粒后42h后，加入10μM的MG-132，作用6h后，提取蛋白，Westernboltting檢測(cè)Vimentin表達(dá)的情況，另外轉(zhuǎn)染RUNX3表達(dá)質(zhì)粒后做microRNA基因芯片篩查，對(duì)篩查結(jié)果進(jìn)行查閱文獻(xiàn)和microRNA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析。
　　 結(jié)果:加入蛋白酶體抑制劑MG-132后Vimentin的表達(dá)水平并沒(méi)有恢復(fù)。microRNA芯片結(jié)果顯示RUNX3可以顯著上調(diào)miR-30a的表達(dá)，查閱文獻(xiàn)和microRN

11、A數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)miR-30a可以不完全互補(bǔ)結(jié)合在Vimentin基因的3'-UTR區(qū)，抑制Vimentin蛋白的翻譯過(guò)程。
　　 結(jié)論:Runx3調(diào)控Vimentin的表達(dá)不是通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑實(shí)現(xiàn)的，芯片結(jié)果顯示RUNX3可以上調(diào)miR-30a的表達(dá)，數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)顯示miR-30a可以抑制Vimentin蛋白的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，從而說(shuō)明RUNX3可以在轉(zhuǎn)錄后水平抑制Vimentin蛋白的表達(dá)。
　　 第四部分:RUNX3通

12、過(guò)miR-30a調(diào)控Vimentin基因表達(dá)影響EMT的發(fā)生
　　 目的:驗(yàn)證RUNX3通過(guò)上調(diào)miR-30a從而抑制Vimentin基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)這一分子機(jī)制。
　　 方法:轉(zhuǎn)染RUNX3表達(dá)質(zhì)粒48h和siRNA干擾RUNX372h后，Trizol法提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，QRT-PCR檢測(cè)miR-30家族的表達(dá)情況，miR-30家族mimics轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后提取蛋白，Westernboltting檢測(cè)Vime

13、ntin表達(dá)的情況。通過(guò)分子克隆構(gòu)建了Vimentin的mRNA的3'UTR的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的野生型和突變型pMIR-Vimentin3'UTR,pMIR-Vimentin3'UTRMUT1和pMIR-Vimentin3'UTRMUT2，轉(zhuǎn)染miR-30a24h后轉(zhuǎn)染報(bào)告質(zhì)粒，48h后進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)。
　　 結(jié)果:QRT-PCR結(jié)果證實(shí):高表達(dá)RUNX3確實(shí)可以顯著升高miR-30a的水平，干擾RUNX3表達(dá)可以抑制miR-

14、30a的表達(dá)。RUNX3的變化對(duì)miR-30e沒(méi)有顯著性影響。miR-30amimics轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后Vimentin的表達(dá)水平顯著降低，和轉(zhuǎn)染RUNX3表達(dá)質(zhì)粒的效果一致。miR-30e對(duì)Vimentin蛋白表達(dá)沒(méi)有影響。熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示相對(duì)于轉(zhuǎn)染miR-1011，野生型和Mutl突變報(bào)告系統(tǒng)中轉(zhuǎn)染miR-30a熒光素酶表達(dá)值降低，Mut2突變報(bào)告系統(tǒng)中轉(zhuǎn)染miR-30a熒光素酶值恢復(fù)到對(duì)照組的水平。
　　 結(jié)論:RUNX3確

15、實(shí)可以顯著正性調(diào)控miR-30a的表達(dá)，但對(duì)miR-30e的調(diào)控不明顯，miR-30a可以靶向結(jié)合到Vimentin的3'UTR上的第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)上，抑制Vimentin的mRNA的翻譯，降低Vimentin蛋白的表達(dá)。腫瘤抑制因子RUNX3影響EMT的分子機(jī)制是RUNX3可以上調(diào)miR-30a的表達(dá)從而間接抑制了Vimentin的表達(dá)水平。
　　 研究創(chuàng)新性和意義
　　 腫瘤抑制因子RUNX3與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有密切相關(guān)

16、性，本研究在細(xì)胞水平上首次揭示了在人胃癌細(xì)胞中RUNX3可以影響轉(zhuǎn)移過(guò)程中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)現(xiàn)象，并且證明RUNX3可以通過(guò)上調(diào)miR-30a的表達(dá)，miR-30a又通過(guò)靶向結(jié)合Vimentin的3，UTR，從而抑制EMT中關(guān)鍵的間質(zhì)標(biāo)志分子Vimentin的表達(dá)，從而起到抑制EMT的發(fā)生和胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。通過(guò)此研究在RUNX3與EMT之間的關(guān)系上發(fā)現(xiàn)一個(gè)重要通路，并且在分子標(biāo)志物方面對(duì)于胃癌的臨床診斷和治療提供重要的分子