RUNX3表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞生長的分子機(jī)制及臨床研究.pdf

1、研究背景與目的：食管鱗癌(Esophageal squamous cell cancer，ESCC)，它是來自食道上皮細(xì)胞的原發(fā)性食管癌的其中一種類型，在世界范圍內(nèi)尤其是在中國有著很高發(fā)病率的一種惡性腫瘤。ESCC的目前的治療技術(shù)包括手術(shù)、放療和化療，盡管目前隨著早期診斷和治療方法上的進(jìn)步，但ESCC卻仍然是致死率很高的惡性腫瘤之一。在我國的食管癌患者中，約有90％以上的患者病理類型為食管鱗狀細(xì)胞癌。在解剖上，食管組織結(jié)構(gòu)與其他消化管道

2、存在差異，在食管的粘膜固有層和粘膜肌層中含有豐富的淋巴管道，因此，以至于在T分期較早的食管癌中也可以發(fā)生淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。資料顯示，在手術(shù)完全切除的食管癌患者中，仍有許多早期患者在完全切除腫瘤后的2-3年之內(nèi)仍然出現(xiàn)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)。因此發(fā)現(xiàn)新的、有效的抗食管鱗癌的方法是當(dāng)務(wù)之急。隨著廣大研究者對腫瘤分子機(jī)制不斷的深入認(rèn)識，現(xiàn)在已將惡性腫瘤定義為一種多因子、多步驟和多基因參與的全身性疾病。因此，在近幾年中，腫瘤的生物學(xué)治療以及基因治療成為

3、腫瘤治療的研究熱點和新希望。
　　許多研究表明食管鱗癌的發(fā)生和發(fā)展是多因素，多步驟和多個基因參與的結(jié)果。抑癌基因也稱作隱性癌基因，這類基因在控制細(xì)胞生長、增殖及分化過程中起著十分重要的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，并能潛在地抑制腫瘤生長。如果抑癌基因的功能失活或出現(xiàn)基因缺失、突變等異常，就可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。腫瘤抑制基因的失活和變異的機(jī)制參與ESCC通過遺傳和表觀遺傳異常的積累發(fā)展，演變從蔓延前的侵入性食管癌病變，一般以惡

4、性細(xì)胞表現(xiàn)出異常的重要基因表達(dá)。因此，發(fā)現(xiàn)參與ESCC腫瘤發(fā)生和發(fā)展的新基因，在探索食管鱗癌的生成和發(fā)展中具有重要的臨床價值。
　　Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(runt-related transcription factor3 gene，RUNX3)蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一個轉(zhuǎn)錄因子，它是哺乳動物Runt家族進(jìn)化的基礎(chǔ)，其定位于人染色體1號短臂

5、1p36上。Runt家族成員均具有含123個氨基酸RuntDomain(RD區(qū)域)，Runx蛋白與Smad2、Smad3形成復(fù)合物傳遞TGF-β/activin信號，與人類疾病的發(fā)生密切相關(guān)。RUNX3對細(xì)胞生長起負(fù)性調(diào)節(jié)，在TGF-β介導(dǎo)的細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化與凋亡過程中起到重要的作用。RUNX3首先在胃癌中發(fā)現(xiàn)，其廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞中，如消化道上皮細(xì)胞、間葉細(xì)胞、血液細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等，與細(xì)胞生長、發(fā)育、分化及凋亡有關(guān)，其缺失或失活

6、都可導(dǎo)致多種消化系惡性腫瘤的發(fā)生而倍受關(guān)注。
　　臨床試驗證實RUNX3陰性表達(dá)時腫瘤中淋巴道侵襲能力和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目均明顯增高，RUNX3陰性表達(dá)與食管鱗癌預(yù)后不良相關(guān)，可能是影響預(yù)后的重要因素，即RUNX3蛋白表達(dá)下調(diào)與食管鱗癌的臨床TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，參與食管癌變進(jìn)展過程。但是目前尚沒有關(guān)于RUNX3對食管鱗癌細(xì)胞分子水平作用研究的相關(guān)報道。本研究通過應(yīng)用免疫組織化學(xué)、western-blot免疫印跡、實時定量-聚合

7、酶聯(lián)反應(yīng)的實驗方法分別從蛋白和基因的不同角度研究了RUNX3在食管鱗癌組織中的表達(dá)以及對食管鱗癌細(xì)胞系生物學(xué)活性和腫瘤發(fā)生的相關(guān)性，并探討了RUNX3與食管鱗癌各臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。旨在為探索食管癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，尋找特異的預(yù)后指標(biāo)，為食管鱗癌的治療確定新的治療目標(biāo)和提供基因治療食道癌的理論基礎(chǔ)。
　　第一部分 RUNX3過表達(dá)在體內(nèi)體外對食管鱗癌Eca109細(xì)胞系的生物學(xué)行為抑制的研究
　　目的：探討RUNX3

8、基因表達(dá)與食管鱗癌患者的臨床相關(guān)性的關(guān)系以及食管鱗癌細(xì)胞系Eca109過表達(dá)RUNX3后體外和體內(nèi)的生物學(xué)行為改變。
　　方法：免疫組織化學(xué)檢測食管鱗癌患者RUNX3的表達(dá)與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨床相關(guān)性，構(gòu)建并用RT-PCR和Western-blotting檢驗穩(wěn)定過表達(dá)RUNX3的Eca109細(xì)胞系。細(xì)胞免疫熒光染色鑒定RUNX3蛋白的定位。CCK-8、細(xì)胞劃痕試驗被用來確定Eca109細(xì)胞的增殖情況。TUNEL實驗是分析過表達(dá)后細(xì)

9、胞的凋亡。Transwell侵襲實驗對比檢測細(xì)胞的侵襲能力。通過裸鼠成瘤實驗分別驗證過表達(dá)前后體內(nèi)腫瘤生長的能力。
　　結(jié)果：相比在食管癌周圍的正常食管上皮組織，RUNX3蛋白在食管鱗癌中表達(dá)較低。證實在食管組織中RUNX3的表達(dá)與食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(LNM)(P＜0。01)。我們成功構(gòu)建并驗證了穩(wěn)定過表達(dá)RUNX3的Eca109細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)RUNX3過表達(dá)能抑制細(xì)胞增殖，遷移和侵襲，并且誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞的凋亡。在裸鼠

10、體內(nèi)實驗中顯著地抑制Eca109細(xì)胞的致瘤性。
　　結(jié)論：人類食管鱗癌組織RUNX3表達(dá)與ESCC進(jìn)展顯著相關(guān)。RUNX3的過表達(dá)顯著抑制ESCC細(xì)胞增殖、遷移、入侵和致瘤性。
　　第二部分 RUNX3基因阻抑食管鱗癌細(xì)胞生長的分子機(jī)制
　　目的：探討RUNX3過表達(dá)及沉默后食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為及RUNX3與MMP-9，TIMP-1，ICAM-1之間的關(guān)系。
　　方法：采用免疫組織化學(xué)染色檢查90例食管鱗狀細(xì)胞

11、癌標(biāo)本RUNX3表達(dá)以及探討RUNX3的表達(dá)與食管鱗癌階段的相關(guān)性。通過構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)RUNX3及沉默RUNX3的食管鱗癌細(xì)胞系，驗證RUNX3的改變與MMP-9，TIMP-1和ICAM-1表達(dá)作用的關(guān)系。
　　結(jié)果：發(fā)現(xiàn)降低ESCC組織中RUNX3表達(dá)與腫瘤的T分期顯著相關(guān)(P＜0。01)。體外實驗中沉默RUNX3導(dǎo)致促進(jìn)Eca9706細(xì)胞生長，細(xì)胞遷移和侵襲。并且RUNX3的降低調(diào)節(jié)MMP-9和ICAM-1在食管鱗癌細(xì)胞中的表

12、達(dá)。相反，在RUNX3過表達(dá)Kyse150細(xì)胞系中MMP-9，ICAM-1顯著減少。
　　結(jié)論：研究表明，食管鱗癌中RUNX3的表達(dá)與食管鱗癌的發(fā)展顯著相關(guān)?；謴?fù)RUNX3的表達(dá)顯著抑制ESCC細(xì)胞遷移、侵襲和腫瘤發(fā)生，這可能是由于RUNX3與MMP-9ICAM-1的表達(dá)有關(guān)，RUNX3在食管鱗癌中可能是一個潛在的治療目標(biāo)。
　　第三部分 5-氮雜胞苷對食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響及其機(jī)制探討
　　目的：探討去甲基化試劑5

13、-氮雜胞苷(5-azacytidine，5-azac)上調(diào)RUNX3基因表達(dá)后，食管癌Eca109細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。
　　方法：體外培養(yǎng)的Eca109細(xì)胞，應(yīng)用10、20和50μtmol/L較低濃度的5-氮雜胞苷干預(yù)72h，實時定量PCR及蛋白質(zhì)印跡法檢測RUNX3基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平改變，甲基化特異性PCR檢測RUNX3基因的甲基化程度變化，細(xì)胞劃痕、Transwell實驗觀察Eca109細(xì)胞遷移及侵襲能力的改變。<

14、br>　　結(jié)果：經(jīng)10、20和50μmol/L5-氮雜胞苷干預(yù)72h后，RUNX3基因的mRNA表達(dá)水平分別增加2.18±0.23、4.57±0.26和6.90±0.36倍，RUNX3蛋白表達(dá)相對系數(shù)分別為0.196±0.004、0.278±0.013和0.396±0.025。Eca109細(xì)胞經(jīng)5-氮雜胞苷處理后，部分RUNX3基因去甲基化。0、20和50μtmol/L5-氮雜胞苷干預(yù)72h后，RUNX3基因的去甲基化條帶亮度值比值分別

15、為0.125±0.003、1.791±0.112和2.987±0.236(P＜0.001)。0、10、20和50μtmol/L5-氮雜胞苷干預(yù)72h后，Eca109細(xì)胞運動至劃痕處細(xì)胞數(shù)分別為715±20.1、398±19.3、302±16.4和124±13.8。相比于對照組，10、20和50μtmol/L干預(yù)組遷移細(xì)胞數(shù)百分率分別為62％、46％和12％，侵襲細(xì)胞數(shù)百分率為60％、45％和8％。
　　結(jié)論：較低濃度5-氮雜胞苷通