RUNX3基因在膀胱移行細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率占成人惡性腫瘤的8％。近年來(lái)全球膀胱癌的發(fā)病率在增加，在歐洲居常見(jiàn)腫瘤的第五位，在美國(guó)居第四位。在我國(guó)膀胱癌是最常見(jiàn)的泌尿系惡性腫瘤，發(fā)病率高，位居全身腫瘤的第八位，近年來(lái)，我國(guó)部分城市腫瘤發(fā)病率報(bào)告顯示膀胱癌發(fā)病率有增高趨勢(shì)。 膀胱癌的發(fā)生是一個(gè)多步驟，多階段，多基因的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，膀胱癌發(fā)生發(fā)展的一重要機(jī)制是抑癌基因的突變、失活或丟失。在復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過(guò)程中因抑癌基因的突變或缺失不能修復(fù)

2、受損的DNA，失去對(duì)信號(hào)通路的活性下調(diào)作用及抑制細(xì)胞增殖的功能，使攜帶有異常DNA的細(xì)胞無(wú)限制地復(fù)制、增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。 人類(lèi)RUNX3基因?qū)儆谝职┗颍挥谌旧w1p36.1。編碼產(chǎn)物runx3蛋白是由α、β亞單位組成的異源二聚體，在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起重要作用。 國(guó)內(nèi)有關(guān)RUNX3基因的研究剛剛起步，為數(shù)不多的幾項(xiàng)研究也集中在胃癌和肝細(xì)胞癌中，國(guó)外有關(guān)RUNX3基因的研究主要集中于消化道腫瘤，在膀胱癌中的研究?jī)H有Su

3、zuki和Kim提及。Suzuki及Kim等發(fā)現(xiàn)RUNX3基因的表達(dá)與膀胱癌相關(guān)，但并未具體研究RUNX3基因表達(dá)與膀胱癌分期、腫瘤復(fù)發(fā)以及腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，且他們的研究?jī)H把RUNX3基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀況作為研究指標(biāo)，缺乏對(duì)RUNX3基因表達(dá)水平的具體量化。我的導(dǎo)師周祥福教授在前期實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用RT-PCR、甲基化特異性PCR和非甲基化PCR檢測(cè)膀胱癌T24細(xì)胞及正常膀胱組織中RUNX3基因的表達(dá)以及基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化

4、狀態(tài)。同時(shí)構(gòu)建真核載體的pIRES2-EGFP-RUNX3質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染膀胱癌T24細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，結(jié)果提示膀胱癌T24細(xì)胞可能因RUNX3基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島發(fā)生甲基化，致基因無(wú)法表達(dá)，轉(zhuǎn)染野生型RUNX3抑癌基因后促進(jìn)了膀胱癌T24細(xì)胞的凋亡。本課題采用RT-PCR及熒光定量PCR技術(shù)檢查BTCC組織及正常膀胱組織中RUNX3基因的表達(dá)水平，同時(shí)應(yīng)用WESTERN BLOT技術(shù)檢測(cè)runx3蛋白的表達(dá)水平，明確BT

5、CC組織中RUNX3基因的表達(dá)水平與腫瘤的分期、分級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，探討RUNX3基因?yàn)锽TCC的診斷、治療以及隨訪(fǎng)提供幫助的可能性。 研究目的： 1、明確RUNX3基因在正常膀胱粘膜組織和BTCC組織中的表達(dá)情況。 2、明確runx3蛋白在正常膀胱粘膜組織和BTCC組織中的表達(dá)情況。 3、探討B(tài)TCC組織中RUNX3基因的表達(dá)水平與腫瘤臨床分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。 方法與

6、結(jié)果： 一、BTCC組織和正常膀胱粘膜組織的獲取及組織總RNA和核蛋白的提取 在無(wú)菌條件下，所有標(biāo)本均用剪刀剪碎，分兩部分保存于凍存管，一部分用于提取組織總RNA，另一部分用于提取組織總核蛋白。分別應(yīng)用總RNA提取純化系統(tǒng)SV、GENMED組織可溶性總核蛋白制備試劑盒提取組織總RNA和總核蛋白結(jié)果：共獲取41例BTCC組織標(biāo)本和7例正常膀胱粘膜組織標(biāo)本，每例標(biāo)本均得到總RNA和總核蛋白。 二、RT-PCR檢測(cè)RU

7、NX3基因的表達(dá)情況 將48例標(biāo)本的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后將cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增RUNX3基因，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。 結(jié)果：41例BTCC組織有39例RUNX3陽(yáng)性表達(dá)，7例正常膀胱組織有6例RUNX3陽(yáng)性表達(dá)，BTCC組織與正常膀胱組織陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)明顯差異(P>0.1)。 三、熒光定量PCR檢測(cè)檢測(cè)RUNX3基因的表達(dá)水平 構(gòu)建真核載體的RUNX3-pRecerver-M01a質(zhì)粒，分別用

8、5中濃度梯度的質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，擬合RUNX3基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將48例總RNA標(biāo)本的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，得到相應(yīng)的Ct值，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)換算成相應(yīng)的拷貝數(shù)。 結(jié)果：成功構(gòu)建出RUNX3-pRecerver-M01a質(zhì)粒，擬合的RUNX3基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系良好，得到各組織樣本單位質(zhì)量的拷貝數(shù)。正常膀胱組織RUNX3表達(dá)水平明顯高于BTCC組織(P<0.05)，BTCC組織中RUNX3表達(dá)水平隨著腫瘤分級(jí)的增

9、高而降低(P<0.05)，隨著腫瘤分期的增高而降低(P<0.05)，行根治行膀胱切除的24例樣本，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組RUNX3表達(dá)水平明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。 四、Western blot檢測(cè)runx3蛋白表達(dá)應(yīng)用Western blot免疫印跡法檢測(cè)2例正常膀胱組織和2例BTCC組織中runx3蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果：2例正常膀胱組織和2例BTCC組織中runx3蛋白均有表達(dá)，但是BTCC組織runx3表帶明顯暗于正常膀胱組

10、織，進(jìn)一步驗(yàn)證了正常膀胱組織RUNX3表達(dá)水平高于BTCC組織。 結(jié)論： 1、RUNX3基因在BTCC組織和正常膀胱組織中均有表達(dá)，BTCC組織與正常膀胱組織RUNX3陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)明顯差異(P>0.05)。 2、runx3蛋白在BTCC組織和正常膀胱組織中均有表達(dá)。 3、RUNX3基因在BTCC組織中的表達(dá)水平與患者的腫瘤的臨床分期明顯相關(guān)，腫瘤的分期越高，基因的表達(dá)水平越低(P<0.05)；RUNX3基