乙酰肝素酶對人胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的研究.pdf

1、目的:
　　研究顯示,乙酰肝素酶（HPA）能促進(jìn)胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移。但其促進(jìn)胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未明確。上皮一間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。為此,本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，探討乙酰肝素酶是否通過誘導(dǎo)人胃癌MGC803細(xì)胞發(fā)生EMT促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　方法:
　　1、在無內(nèi)源性表達(dá)HPA的人胃癌細(xì)胞MGC803中轉(zhuǎn)染載體pcDNA3．1(HPA)、pcDNA3．1(GFP)、pcDNA3．1(

2、+)，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，Western Blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后，目標(biāo)蛋白表達(dá)情況。
　　2、相差倒置顯微鏡觀察人胃癌細(xì)胞MGC803轉(zhuǎn)染pcDNA3．1(HPA)后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　3、在激光掃描共聚焦顯微鏡下直接觀察觀察人胃癌細(xì)胞MGC803轉(zhuǎn)染pcDNA3．1(HPA)后β-catenin表達(dá)變化。
　　4、Western Blot技術(shù)檢測人胃癌細(xì)胞MGC803轉(zhuǎn)染pcDNA3．1(HPA)后細(xì)胞中上

3、皮標(biāo)志物E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的變化。
　　5、細(xì)胞劃痕實驗觀察觀察人胃癌細(xì)胞MGC803轉(zhuǎn)染pcDNA3．1(HPA)后細(xì)胞遷移能力變化。
　　6、Transwell實驗觀察人胃癌細(xì)胞MGC803轉(zhuǎn)染pcDNA3．1(HPA)后細(xì)胞侵襲能力變化。
　　7、利用免疫組化方法檢測人胃癌組織中不同的病理參數(shù)間乙酰肝素酶、上皮標(biāo)志物和間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)差異，觀察各病理參數(shù)下

4、的胃癌細(xì)胞上述蛋白表達(dá)情況及關(guān)系，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，闡明它們之間的相關(guān)性，進(jìn)一步驗證體外細(xì)胞水平得到結(jié)果。
　　結(jié)果:
　　1、在無內(nèi)源性表達(dá)HPA的人胃癌細(xì)胞MGC803中轉(zhuǎn)染載體pcDNA3．1(HPA)、pcDNA3．1(GFP)、pcDNA3．1(+)，轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，可見轉(zhuǎn)染pcDNA3．1(GFP)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率約為40％-50%，Western Blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后三組人胃癌細(xì)胞MGC803

5、以及對照組（Control）中HPA含量，轉(zhuǎn)染pcDNA3．1(HPA)的人胃癌細(xì)胞MGC803 HPA的表達(dá)高于其他組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。
　　2、倒置顯微鏡下觀察，人胃癌細(xì)胞MGC803過表達(dá)乙酰肝素酶重組蛋白后形態(tài)變梭。
　　3、通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，隨著轉(zhuǎn)染時間的推移，β-catenin發(fā)生核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，表達(dá)位置由胞膜向胞漿、胞核轉(zhuǎn)移。
　　4、Western Blot技術(shù)檢測人胃癌細(xì)胞M

6、GC803轉(zhuǎn)染前后蛋白含量變化，上皮標(biāo)志物E-cadherin下降，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin增高，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。
　　5、細(xì)胞劃痕實驗證明，轉(zhuǎn)染后MGC803細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染前后相比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。
　　6、Transwell實驗證明，轉(zhuǎn)染后人胃癌細(xì)胞MGC803的侵襲能力增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染前后相比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.0

7、5）。
　　7、免疫組化測定胃癌組織中蛋白量變化：低分化胃癌、中分化胃癌與高分化胃癌中HPA以及上皮標(biāo)志物E-cadherin，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、N-cadherin的表達(dá)存在差異(p＜0.05)，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。侵襲深度不同HPA以及上皮標(biāo)志物E-cadherin，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、N-cadherin的表達(dá)具有差異性(p＜0.05),結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤中HPA以及上皮標(biāo)

8、志物E-cadherin，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、N-cadherin的表達(dá)具有差異性(p＜0.05),結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。不同位置的胃癌的HPA以及上皮標(biāo)志物E-cadherin，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin、N-cadherin的表達(dá)也存在差異(p＜0.05)。HPA以及上皮標(biāo)志物E-cadherin，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin、N-cadherin的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小無明顯相關(guān)（p＞0.05）。
　　結(jié)