乙酰肝素酶反義寡核苷酸誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、目的:在體外實驗中,通過觀察乙酰肝素酶(HPA)反義寡核苷酸AS-ODN對人胃腺癌細胞株SGC-7901細胞HPA-mRNA表達的影響,探討其對胃癌細胞的抑制作用;通過觀察AS-ODN誘導(dǎo)SGC-7901細胞的凋亡及其與凋亡調(diào)控基因p53、bcl-2、Survivin表達的關(guān)系,探討其誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡的可能性及其機制;通過觀察AS-ODN對細胞間粘附分子CD54、血管內(nèi)皮生長因子VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2以及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑

2、TIMP-2表達的影響,探討其抑制胃癌細胞的作用機制.方法:根據(jù)HPA的基因序列設(shè)計互補于mRNA起始密碼區(qū)的反義寡脫氧核苷酸(AS-ODN),并設(shè)計與其堿基組成相同,但堿基順序隨機排列的無義寡核苷酸(NS-ODN)作為對照.寡核苷酸序列行硫代磷酸化修飾.實驗分為正常對照組(不進行轉(zhuǎn)染)、脂質(zhì)體對照組(轉(zhuǎn)染時只加脂質(zhì)體)、NS-ODN組(以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NS-ODN)和AS-ODN組(以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染AS-ODN).根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果,在以10μl

3、/ml脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的情況下,選擇0.2、0.4、0.8μmol/L為終濃度進行實驗.按照脂質(zhì)體介導(dǎo)法將HPA反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染已培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的SGC-7901細胞,在37℃,5﹪CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24、48、72小時后收集細胞,用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測轉(zhuǎn)染前后細胞HPA-mRNA及p53、bcl-2的表達;用倒置相差顯微鏡及掃描電鏡觀察轉(zhuǎn)染前后細胞的形態(tài)學(xué)變化;用DNA末端原位標記染色法(TUNEL)檢測轉(zhuǎn)染

4、前后細胞的凋亡指數(shù);用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染前后細胞的凋亡率、bcl-2及CD54的表達;用噻唑藍(MTT)法檢測轉(zhuǎn)染前后細胞的增殖情況;用免疫細胞化學(xué)的方法檢測轉(zhuǎn)染前后細胞survivin、VEGF、MMP-2以及TIMP-2的表達情況.結(jié)論:1、AS-ODN轉(zhuǎn)染后SGC-7901細胞HPA-mRNA濃度下降,提示HPA反義寡核苷酸能夠通過封閉HPA的基因而下調(diào)HPA-mRNA的表達.2、AS-ODN轉(zhuǎn)染后SGC-7901細胞出現(xiàn)了典型的

5、凋亡細胞的形態(tài)學(xué)變化,細胞凋亡指數(shù)明顯增加,流式細胞儀直方圖上出現(xiàn)典型的亞二倍體的"凋亡峰",細胞凋亡率明顯增加,細胞增殖受到抑制,提示誘導(dǎo)凋亡是HPA反義寡核苷酸抑制胃癌細胞的機制之一.3.AS-ODN轉(zhuǎn)染后SGC-7901細胞凋亡誘導(dǎo)基因p53的表達上調(diào),凋亡抑制基因bcl-2的表達下調(diào),而凋亡抑制基因Survivin的表達變化無統(tǒng)計學(xué)意義,提示HPA反義寡核苷酸誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生凋亡與其上調(diào)p53的表達和下調(diào)bcl-2的表達有關(guān),而