TRAIL聯(lián)合XIAP反義寡核苷酸誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、TRAIL又稱凋亡素-2配體(APO-2ligand，APO-2L)，是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡誘導(dǎo)配體，屬腫瘤壞死因子(TNF)家族，通過(guò)與其跨膜的死亡受體(DR)相結(jié)合，激活caspase酶(半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶)依賴的細(xì)胞凋亡途徑，caspase-3是該凋亡通路上最主要的終末剪切酶[3]。研究表明，TRAIL可以引起多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞卻沒(méi)有毒性作用[1、12]，提示TRAIL有可能成為新一代廣譜抗腫瘤藥物。目前的研究

2、證明，TRAIL對(duì)大多數(shù)來(lái)自肝、胃、血液及皮膚的惡性腫瘤細(xì)胞有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)有很多的腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡耐受[35]引，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用，提高這些腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性成為目前亟待解決的問(wèn)題。目前有關(guān)TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究多集中在消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)腫瘤及黑色素瘤方面，有關(guān)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的相關(guān)研究，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。 XIAP是一種新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制因子，屬凋亡抑制蛋白(IAPs)

3、家族，通過(guò)抑制caspase酶活性而對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程起重要調(diào)控作用。BIR結(jié)構(gòu)域(桿狀病毒1AP重復(fù)序列區(qū)，BIR)和RING鋅指結(jié)構(gòu)域是IAPs家族抑制caspase活性，發(fā)揮凋亡抑制作用不可缺少的結(jié)構(gòu)。XIAP分子N一端的3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合并抑制caspase-3、caspase-7和caspase-9，XIAP的C一端有1個(gè)RING鋅指結(jié)構(gòu)域，具有泛素連接酶E3活性，可以促進(jìn)與XAIP相互作用的蛋白質(zhì)泛素化降解。因此，XIAP

4、既通過(guò)BIR結(jié)構(gòu)域抑制caspase活性，也通過(guò)RING結(jié)構(gòu)域催化caspase泛素化降解，從而阻止多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。通過(guò)下調(diào)細(xì)胞中XIAP的表達(dá)，解除XIAP對(duì)caspase酶的抑制，有可能成為提高caspase酶依賴的TRAIL誘凋亡通路效率的有效途徑。國(guó)外已有學(xué)者通過(guò)利用XIAP反義寡核苷酸(XIAP-ASODN)封閉XlAP的表達(dá)，在肝癌細(xì)胞中觀察到了caspase酶表達(dá)的增加。 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤，

5、在神經(jīng)上皮性腫瘤中占22.3％，具有惡性程度高、生長(zhǎng)迅速、病程短等特點(diǎn)[54]。目前對(duì)該瘤的治療方案多以手術(shù)為主，或術(shù)后輔以放療、化療或免疫治療。由于腫瘤惡性程度高，常常侵犯幾個(gè)腦葉，術(shù)后又極易復(fù)發(fā)，因此，上述綜合治療方法效果并不十分理想。有資料顯示，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤目前的平均生存時(shí)間僅為1年，這對(duì)人們的身體健康構(gòu)成極大威脅。因此，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域成為一個(gè)世界性難題和研究熱點(diǎn)。以往的研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅與腫瘤細(xì)胞的克隆性

6、異常增生有關(guān)，而且與腫瘤細(xì)胞正常凋亡功能的減弱有密切關(guān)系。因此，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療研究中，腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)治療逐漸引起人們的重視。 上述研究表明，在caspase酶依賴的凋亡通路中，TRAIL和XIAP是起正性作用和負(fù)性作用的兩個(gè)方面。有關(guān)TRAIL及XIAP-ASODN的獨(dú)立研究在部分腫瘤中已有開(kāi)展，但是，TRAIL聯(lián)合XIAP-ASODN誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究，國(guó)內(nèi)外尚屬空白。為探討TRAIL對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤凋亡的誘導(dǎo)作用，

7、以及XIAP-ASODN對(duì)TRAIL誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞凋亡的增效作用，本研究采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的反義寡核苷酸體內(nèi)外治療法，以及免疫組織化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤體內(nèi)外治療的相關(guān)研究。本研究分為三個(gè)部分。 第一部分，TRAIL受體及XIAP在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究。 第二部分，TRAIL聯(lián)合XIAP-ASODN體外誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的實(shí)驗(yàn)研究。 第三部分，TRAIL聯(lián)合XIAP-ASODN在裸鼠體內(nèi)誘

8、導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤凋亡的實(shí)驗(yàn)研究。 結(jié)論： 本研究首次應(yīng)用免疫組化、RT-PCR、Westernblot、TUNEL、FCM等技術(shù)，聯(lián)合檢測(cè)了TRAIL-R和XIAP在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及其A-172細(xì)胞株中的表達(dá)，并在體內(nèi)外系統(tǒng)地觀察了TRAIL、XIAP-ASODN及TRAIL聯(lián)合XIAP-ASODN對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的凋亡誘導(dǎo)治療作用，得出如下結(jié)論： 1．在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤TRAIL/TRAIL-R凋亡通路中，起重要調(diào)控作用

9、的TRAIL-R是DR4、DR5和DcRl。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，存在著DR高表達(dá)和DcRl低表達(dá)的差異性表達(dá)，差異性表達(dá)的調(diào)控位于轉(zhuǎn)錄后水平，這種差異性表達(dá)為利用TRAIL進(jìn)行膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的凋亡誘導(dǎo)治療奠定了理論基礎(chǔ)。 2．XIAP在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中普遍高表達(dá)，這可能是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤逃逸凋亡的內(nèi)在原因之一，同時(shí)也是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡敏感性不強(qiáng)的重要原因；XIAP-ASODN能夠有效地下調(diào)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中XIAP的表達(dá)，同

10、時(shí)，提高TRAIL誘凋亡通路中關(guān)鍵酶caspase-3的表達(dá)。 3.膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床放射治療的內(nèi)在機(jī)制之一，是通過(guò)上調(diào)DR及下調(diào)XIAP的表達(dá)，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性。 4.經(jīng)過(guò)觀察不同濃度的TRAIL及XIAP-ASODN對(duì)A一172細(xì)胞的作用過(guò)程，發(fā)現(xiàn)200ng/m1和300nM分別是TRAIL和XIAP-ASODN下調(diào)XIAP表達(dá)、抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖的最佳濃度。 5．TRAIL聯(lián)合XIAP-A