VEGF反義寡核苷酸治療皮膚血管瘤的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下四個部分展開論述：
　　第一部分 皮膚血管瘤中VEGF和NOS的表達及其與血管增生的關系
　　目的：研究內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)及血管內皮生長因子(VEGF)在增生期皮膚血管瘤組織中的表達及相關性,探討它們在皮膚血管瘤血管生成中的作用。
　　方法：應用免疫組織化學方法檢測51例增生期皮膚血管瘤標本中eNOS、iNOS和 VEGF的表達,第Ⅷ因子相關抗原(FⅧRAg)血

2、管內皮細胞特異性染色計數(shù)腫瘤微血管密度(MVD)。
　　結果：42例血管瘤組織表達VEGF,32例表達iNOS,37例表達eNOS,血管畸形表達較弱或不表達eNOS,iNOS和 VEGF;eNOS表達陽性血管瘤標本的MVD與表達陰性者差異無顯著性(P>0.05);iNOS表達陽性血管瘤標本的MVD與表達陰性者差異有顯著性(P<0.05)。VEGF表達陽性血管瘤的MVD與表達陰性者差異有極顯著性(P<0.01)。
　　結論：i

3、NOS在VEGF的表達和調節(jié)血管生成過程可能起著重要作用;MVD隨著VEGF和iNOS表達的增強而增加,說明兩者對血管瘤血管生成具有促進作用。
　　第二部分 VEGF反義寡核苷酸在血管瘤內皮細胞中的轉染
　　目的：觀察血管內皮生長因子反義寡核苷酸(VEGF AS-ODN)在皮膚血管瘤內皮細胞中的轉染及表達。
　　方法:體外培養(yǎng)皮膚血管瘤內皮細胞,并對其進行鑒定;設計反義寡核苷酸(AS-ODN)、正義寡核苷酸(S-ODN

4、)和錯義寡核苷酸(MS-ODN),并對寡核苷酸堿基均進行硫化修飾(PS-ODN),分析寡核苷酸在血清培養(yǎng)液中穩(wěn)定性;并將脂質體介導的VEGF反義、正義及錯義寡核苷酸進行轉染;采用MTT法測定各組細胞的增殖速度并繪制細胞生長曲線,并觀察VEGF反義寡核苷酸在不同時間點(24、48和72小時)對內皮細胞生長的抑制,確定其最佳轉染時間和濃度;同時運用免疫組化技術檢測VEGF的蛋白表達的變化。
　　結果:AS-ODN組細胞的生長受到明顯的

5、抑制,細胞數(shù)增加緩慢,抑制作用在48小時效果最顯著,抑制率達50％以上,在72 h后抑制作用逐漸減弱,且這種抑制作用在一定濃度范圍內(2.5~15μmol/L)呈劑量依賴性,其最佳濃度為5μmol/L,而作為對照的S-ODN組、MS-ODN組和空白對照組則抑制作用不明顯;免疫組化表明, AS-ODN作用后的皮膚血管瘤內皮細胞 VEGF蛋白表達陽性細胞數(shù)明顯下降,且表達強度減弱,PI值明顯小于對照組,S-ODN組、MS-ODN組與空白對照

6、組間無明顯差別。
　　結論：VEGFAS-ODN能顯著抑制皮膚血管瘤內皮細胞的生長,且于48小時作用最明顯,濃度為5μmol/L時作用最佳。
　　第三部分 VEGF反義寡核苷酸在血管瘤內皮細胞中的表達
　　目的：探討血管內皮生長因子反義寡核苷酸(VEGF AS-ODN)作用后皮膚血管瘤內皮細胞 VEGF mRNA表達及培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白分泌的改變。
　　方法：采用RT-PCR定量檢測各組皮膚血管瘤內皮細胞中

7、VEGF mRNA含量的變化;ELISA檢測各組皮膚血管瘤內皮細胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白分泌的改變。
　　結果：用5μmol/L的SP-ODN作用48h后,RT-PCR結果顯示:VEGF AS-ODN處理組VEGFmRNA表達水平較空白對照組明顯下降,而S-ODN組、MS-ODN處理組與空白對照組比較,其 VEGF mRNA表達未見明顯改變。ELISA結果顯示:VEGF AS-ODN處理組細胞培養(yǎng)上清液中的VEGF蛋白分泌濃度較

8、空白對照組明顯下降,而S-ODN組、MS-ODN處理組與空白對照組比較VEGF濃度未見明顯變化。
　　結論：VEGF AS-ODN轉染可以有效地抑制血管瘤內皮細胞 VEGFmRNA表達的含量,降低VEGF蛋白分泌,因而可以有效地抑制血管瘤內皮細胞的生長。
　　第四部分 VEGF反義寡核苷酸在血管瘤內皮細胞中生物學特性的檢測
　　目的：研究血管內皮生長因子反義寡核苷酸(VEGF AS-ODN)對皮膚血管瘤內皮細胞體外生物

9、學特性的影響。
　　方法：體外培養(yǎng)皮膚血管瘤內皮細胞;脂質體介導VEGF AS-ODN、S-ODN和MS-ODN進行轉染;在5μmol/L濃度下作用48h后,通過流式細胞儀檢測VEGF AS-ODN、S-ODN、MS-ODN和空白對照組對皮膚血管瘤內皮細胞的細胞周期的影響。
　　結果：VEGF AS-ODN組皮膚血管瘤內皮細胞在作用48h后,與S-ODN組、MS-ODN組及空白對照組相比,G0/G1期細胞增加,而S期和G2/