反義寡核苷酸抑制LA-N-5細(xì)胞VEGF表達(dá)及生物效應(yīng)的研究.pdf

1、背景：神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童最常見(jiàn)的顱外實(shí)體腫瘤，而新生血管的形成是實(shí)體瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵。目前治療腫瘤的各種藥物主要是針對(duì)腫瘤細(xì)胞本身進(jìn)行的，但惡性腫瘤生長(zhǎng)的血管依賴性提示，通過(guò)抑制腫瘤新生血管的形成可以阻止腫瘤的生長(zhǎng)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vaSCHlar endothelial growth factor，VEGF)是高度特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂因子，可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移及血管網(wǎng)的形成，增加血管通透性，從而成為目前抗血

2、管治療的重要靶向。文獻(xiàn)報(bào)道，VEGF在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤及其細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)。ASODN技術(shù)是一種可以選擇性和特異性地阻斷目的基因表達(dá)的技術(shù)，是基因治療的重要組成部分。由于它設(shè)計(jì)容易、合成簡(jiǎn)單、樣式多樣、具有高度的靶異性(通過(guò)堿基互補(bǔ)原理)、較強(qiáng)的局部性和針對(duì)性，因而可以設(shè)計(jì)針對(duì)VEGF基因的ASODN抑制其超量表達(dá)。 目的：研究VEGF ASODN轉(zhuǎn)染對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤LA-N-5細(xì)胞VEGF基因mRNA表達(dá)的影響以及對(duì)瘤細(xì)胞增殖、

3、分化的影響。 方法：1．采用CY-3紅色熒光標(biāo)記的VEGF寡核苷酸確定 Lipofectamine<'TM>2000介導(dǎo)下VEGF寡核苷酸的轉(zhuǎn)染條件及轉(zhuǎn)染效率；2．運(yùn)用Lipofectamine<'TM>2000介導(dǎo)的VEGF ASODN和SODN轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞LA-N-5，半定量RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞VEGF165和VEGF12lmRNA轉(zhuǎn)染前后不同時(shí)間的表達(dá)變化；3．MTT法測(cè)定轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線及抑制率。實(shí)驗(yàn)

4、分為 ASODN、 ASODN+Lipofectamine<'TM>2000、 SODN、 SODN+ Lipofectamine<"TM>2000、Lipofectamine<'TM>2000和control組共6組。 結(jié)果：1．寡核苷酸：Lipofectamine<'TM>2000體積比為2．5：1時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，可達(dá)73.94±5.62％(P<0.05)； 2．半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示在72小時(shí)VEGF165和VEG

5、F12lmRNA的表達(dá)ASODN組為0.346±0.029和0.227±0.036，ASODN+Lipofectamine<'TM>2000組為0.275±0.035和0.165±0.017， ASODN組及ASODN+Lipofectamine<'TM>2000組都能顯著抑制VEGFmRNA的表達(dá)， ASODN+Lipofectamine<'TM>2000組抑制作用比ASODN組更強(qiáng)(P<0.05)；3．在轉(zhuǎn)染后0、12、24、36、

6、48、60、72小時(shí)用MTT法檢測(cè)瘤細(xì)胞增殖情況的變化， ASODN組和ASODN+Lipofectamine<'TM>2000組能顯著抑制細(xì)胞增殖，于第48小時(shí)抑制率最高，達(dá)39.92±2.74％及55.80±2.52％，且ASODN+ Lipofectamine<'TM>2000組對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用較ASODN組更為明顯(P<0.05)。SODN組、SODN+Lipofectamine<'TM>2000組和control組比較對(duì)L

7、A-N-5細(xì)胞增殖的影響無(wú)顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論：1．寡核苷酸與Lipofectamine<'TM>2000體積比在2.5：1時(shí)轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到73.94％。2．VEGF SODN不能抑制VEGF mRNA的表達(dá)，也不能抑制LA-N-5細(xì)胞的增殖和分化。3．VEGF ASODN可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤LA-N-5細(xì)胞VEGF在mRNA水平的表達(dá)，且ASODN+Lipofectamine<'TM>2000的效果優(yōu)于ASODN，