反義寡核苷酸體外抑制人骨肉瘤細(xì)胞PCNA表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究表明，惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與由于基因表達(dá)調(diào)控異常、生長(zhǎng)因子分泌功能失常、信號(hào)傳導(dǎo)異常、程序化死亡的衰減等方面密切相關(guān)。通過(guò)各種機(jī)制，腫瘤細(xì)胞逃避調(diào)亡不僅是其獲得永生性，發(fā)生和演進(jìn)的重要原因，而且可導(dǎo)致抗化療/放療細(xì)胞株的形成。這些因素最終通過(guò)DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的異常分化與無(wú)限增殖。我們研究與腫瘤細(xì)胞增殖和調(diào)亡的相關(guān)基因的表達(dá)及其與惡性腫瘤發(fā)生、演進(jìn)之間的關(guān)系，對(duì)于進(jìn)一步明確惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)理、提高治愈率和開(kāi)辟新的治

2、療途徑有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。 骨肉瘤是除漿細(xì)胞骨髓瘤以外骨骼系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，主要見(jiàn)于15～25青少年，男性多于女性。其發(fā)病率各國(guó)的統(tǒng)計(jì)數(shù)字差異較大，約1/10萬(wàn)～0.1/10萬(wàn)，在我國(guó)尚無(wú)關(guān)于其發(fā)病率和死亡率的精確統(tǒng)計(jì)資料。骨肉瘤惡性度高，易早期轉(zhuǎn)移，治療后易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差，危害性大死亡率高。隨著輔助化療、外科手術(shù)技術(shù)、骨重建方法和改進(jìn)臨床分期方法的發(fā)展，越來(lái)越多的患者接受了保肢手術(shù)，并有復(fù)原的希望。但目前的治療方法，

3、五年生存率從50-65％不等，仍有許多患者無(wú)法從中受益。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是致命的結(jié)果，若發(fā)生轉(zhuǎn)移，生存率更低(30％)。目前對(duì)骨肉瘤患者的總體治療效果較差，如何提高骨肉瘤患者的治療率、探索新的治療方法始終是臨床關(guān)注的焦點(diǎn)。 反義核酸基因治療主要依賴(lài)于Watson-Crick的核酸堿基配對(duì)原理，合成與特異基因互補(bǔ)的、小的單鏈寡核苷酸導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，與相應(yīng)mRNA雜交，從而在翻譯水平阻斷某些異?；虻谋磉_(dá)。反義核酸治療技術(shù)因其具有高效簡(jiǎn)

4、便、不需要載體等特點(diǎn)，已成為近年來(lái)腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)之一。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是DNA聚合酶δ的輔助因子，是DNA合成必不可少的物質(zhì)，參與細(xì)胞周期調(diào)控，與核酸代謝中的多種調(diào)節(jié)蛋白密切相關(guān)。研究表明，PCNA在骨肉瘤中高表達(dá)，與惡性程度和預(yù)后呈明顯的相關(guān)性。目前已有以PCNA為反義基因治療靶點(diǎn)的研究見(jiàn)諸報(bào)道，但是PCNA-ASODN作用于人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63后對(duì)PCNA表達(dá)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。我們以增殖細(xì)胞核抗原為靶基因，應(yīng)用

5、脂質(zhì)體介導(dǎo)PCNA-ASODN轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞MG-63，并觀察其對(duì)MG-63細(xì)胞PCNAmRNA、蛋白表達(dá)及細(xì)胞增殖活性的影響。 目的本試驗(yàn)主要是探討PCNA-ASODN抑制人骨肉瘤細(xì)胞MG-63細(xì)胞株P(guān)CNA表達(dá)的效果。 方法應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的PCNA反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞MG-63，RT-PCR、Westernblot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后PCNAmRNA及蛋白的表達(dá)，MTT比色法和集落形成試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。