核仁素反義寡核苷酸對人骨肉瘤細胞MG-63抑制作用的實驗研究.pdf

1、本研究共分為三部分。
　　第一部分 核仁素反義寡核苷酸的合成及功能鑒定
　　目的:
　　合成核仁素隨機、正義和反義寡核苷酸序列，為研究核仁素反義寡核苷酸對人骨肉瘤細胞MG-63增殖的抑制作用做準備。
　　方法:
　　(1)采用全硫代修飾合成核仁素隨機、正義和反義寡核苷酸序列，利用陽離子脂質(zhì)體將其包裹后轉染進入體外培養(yǎng)的人骨肉瘤細胞MG-63中;
　　(2)通過熒光顯微鏡觀察寡核苷酸是否有效轉染進入人骨

2、肉瘤細胞MG-63內(nèi);
　　(3)RT-PCR、Western Bloting檢測轉染核仁素反義寡核苷酸后人骨肉瘤細胞MG-63中核仁素mRNA及蛋白表達的變化。
　　結果:
　　(1)熒光顯微鏡下觀察，可見約65％的細胞染上綠色熒光;
　　(2) RT-PCR及Western Bloting檢測轉染核仁素反義寡核苷酸后人骨肉瘤細胞MG-63中核仁素mRNA及蛋白表達，結果顯示:核仁素反義寡核苷酸抑制了人骨肉瘤細

3、胞MG-63中核仁素mRNA和蛋白的表達，可使其表達水平下調(diào)。
　　結論:
　　(1)成功構建核仁素反義寡核苷酸;
　　(2)有效地將核仁素反義寡核苷酸轉染進入人骨肉瘤細胞MG-63中。
　　第二部分 核仁素反義寡核苷酸對人骨肉瘤細胞MG-63增殖抑制及誘導凋亡的實驗研究
　　目的:
　　探討核仁素反義寡核苷酸在抑制人骨肉瘤細胞MG-63增殖以及體外下調(diào)核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表達與誘導細胞

4、凋亡的作用。
　　方法:
　　(1)將人骨肉瘤細胞MG-63隨機分為四組:對照組、轉染隨機寡核苷酸組、轉染正義寡核苷酸組與轉染反義寡核苷酸組;
　　(2)采用陽離子脂質(zhì)體介導的寡核苷酸技術將核仁素隨機、正義和反義寡核苷酸轉染進入人骨肉瘤細胞MG-63中;
　　(3)用MTT法檢測各組MG-63細胞的增殖率，并用Western Bloting和RT-PCR檢測各組MG-63細胞中核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表

5、達情況;
　　(4)用流式細胞術檢測各組MG-63細胞的凋亡率。
　　結果:
　　(1) MTT檢測各組MG-63細胞增殖率顯示:核仁素反義寡核苷酸著抑制了人骨肉瘤細胞MG-63的增殖，與對照組、轉染隨機寡核苷酸組、轉染正義寡核苷酸組相比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);
　　(2) Western Bloting和RT-PCR檢測各組MG-63細胞中核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表達情況，結果顯示:轉染

6、反義寡核苷酸組與對照組、轉染隨機寡核苷酸組、轉染正義寡核苷酸組相比較，核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);轉染隨機寡核苷酸組、轉染正義寡核苷酸組與對照組相比較，核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表達無明顯影響，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);
　　(3)流式細胞術檢測各組細胞的凋亡率，結果顯示轉染反義寡核苷酸組與對照組、轉染隨機寡核苷酸組、轉染正義寡核苷酸組相比較，細胞凋亡率增高，差異

7、有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　(1)核仁素反義寡核苷酸能抑制人骨肉瘤細胞MG-63增殖;
　　(2)核仁素反義寡核苷酸能誘導人骨肉瘤細胞MG-63凋亡。
　　第三部分 核仁素反義寡核苷酸對人骨肉瘤細胞裸鼠移植瘤的抑制作用
　　目的:
　　探討核仁素反義寡核苷酸在抑制人骨肉瘤細胞裸鼠移植瘤的生長以及在體內(nèi)下調(diào)核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表達與誘導細胞凋亡的作用。
　　方法:

8、
　　(1)將人骨肉瘤細胞MG-63懸液的細胞濃度調(diào)整為1×108/ml，每只裸鼠右前腿背側皮下注射0.2ml細胞懸液（細胞數(shù)為2×107/只），建立人骨肉瘤細胞裸鼠移植瘤動物模型;
　　(2)將構建成功的動物模型隨機分為4組:對照組、隨機寡核苷酸組、正義寡核苷酸組、反義寡核苷酸組;
　　(3)采用瘤旁注射的方式，隨機寡核苷酸組、正義寡核苷酸組、反義寡核苷酸組分別于瘤旁注射2 mg/kg體重的隨機、正義及反義寡核苷酸;

9、對照組瘤旁注射等量生理鹽水，每日1次，共15次，觀察裸鼠及移植瘤的生長狀態(tài);
　　(4)每3天以游標卡尺測量腫瘤1次，HE染色觀察移植瘤組織學形態(tài)，免疫組化檢測各組荷瘤鼠移植瘤組織中核仁素及Bcl-2的表達情況，Western Bloting和RT-PCR檢測各組荷瘤鼠移植瘤組織中核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表達變化情況，流式細胞術檢測各組荷瘤鼠移植瘤組織細胞凋亡率。
　　結果:
　　(1)以人骨肉瘤細胞株MG-

10、63成功構建人骨肉瘤細胞裸鼠移植瘤動物模型;
　　(2)反義寡核苷酸組與對照組、隨機寡核苷酸組、正義寡核苷酸組相比較，反義寡核苷酸組移植瘤體積明顯小于對照組、隨機寡核苷酸組及正義寡核苷酸組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);
　　(3)免疫組化檢測各組荷瘤鼠移植瘤組織中核仁素及Bcl-2的表達情況，結果顯示核仁素反義寡核苷酸在裸鼠體內(nèi)能夠抑制移植瘤組織中核仁素、Bcl-2的表達，與對照組、隨機寡核苷酸組及正義寡核苷酸組相比較

11、，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，隨機寡核苷酸組、正義寡核苷酸組與對照組相比較，移植瘤組織中核仁素、Bcl-2的表達無明顯影響，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);
　　(4)Western Bloting和RT-PCR檢測各組荷瘤鼠移植瘤組織中核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表達變化情況，結果顯示核仁素反義寡核苷酸在裸鼠體內(nèi)能夠抑制移植瘤組織中核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表達，與對照組、隨機寡核苷酸組及正義寡核苷酸組相比

12、較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，隨機寡核苷酸組、正義寡核苷酸組與對照組相比較，移植瘤組織中核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表達無明顯影響，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);
　　(5)流式細胞術檢測各組荷瘤鼠移植瘤組織細胞凋亡率，結果顯示反義寡核苷酸組移植瘤組織細胞凋亡率明顯高于對照組、隨機寡核苷酸組及正義寡核苷酸組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　(1)核仁素反義寡核苷酸在體內(nèi)能夠抑制人骨