細胞周期蛋白G1在骨肉瘤組織中的表達及反義寡核苷酸對瘤細胞增殖調(diào)控的研究.pdf

1、前言：
　　骨肉瘤是最常見的惡性骨腫瘤，好發(fā)于長骨的干骺端，早期即可出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。骨肉瘤的發(fā)生可能是由于多基因突變并長期積累所致，近年來的研究發(fā)現(xiàn)一些細胞周期調(diào)控相關(guān)因子也在骨肉瘤組織中異常表達，并可能在骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。
　　Cyclin G是細胞周期蛋白家族中的一名新成員，至今已鑒定出它有3個家族成員: cyclin G1、cyclin G2和cyclinⅠ，其中cyclin G1和cyclin G2

2、在結(jié)構(gòu)上有高度同源性，但在功能上似乎各自發(fā)揮著自己特有的生物學(xué)作用。人的cyclin G1基因定位在5q32-34，有6個外顯子，第一個內(nèi)含子中含有一個p53蛋白的結(jié)合位點(GCACACGCCCAGGCTAGTCC)，人的cyclin G1基因mRNA長2.8kb。cyclin G1mRNA在骨胳肌中表達水平最高，其次在卵巢、腎臟和結(jié)腸組織中也有較高水平的表達?，F(xiàn)有的研究資料顯示，cyclin G1在細胞增殖、細胞周期檢查點調(diào)控和/或D

3、NA修復(fù)中起作用，并參與誘導(dǎo)細胞凋亡過程，cyclin G1蛋白在細胞周期中隨著G1早期至G1/S期最初表達上調(diào)，持續(xù)表達于整個細胞周期。有研究表明cyclin G1在腫瘤細胞的生長中起重要作用。
　　目的：
　　本研究采用多種方法檢測cyclin G1在骨肉瘤組織中的表達以及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染cyclin G1反義脫氧寡核苷酸(ASON)對骨肉瘤細胞株OS-732增殖的調(diào)控作用。
　　方法：
　　1、應(yīng)用免疫組化S-P

4、法觀察34例骨肉瘤及15例骨軟骨瘤中cyclin G1的表達情況
　　連續(xù)石蠟切片脫蠟至水，3％過氧化氫孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活;滴加正常血清室溫孵育，滴加cyclin G1單克隆抗體、二抗及SP，室溫孵育，DAB顯色。Cyclin G1在細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒著色為陽性表達。
　　2、Western Blot檢測cyclin G1在骨軟骨瘤和骨肉瘤組織中的表達。
　　取新鮮樣品加入裂解緩沖液，剪碎、勻漿、

5、超聲處理，高速低溫離心提取上清蛋白，電泳、轉(zhuǎn)印，經(jīng)封閉后加相應(yīng)的一抗、二抗及顯色試劑檢測。
　　3、RT-PCR檢測cyclin G1 mRNA在骨軟骨瘤和骨肉瘤組織中的表達。
　　Trizol提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，以β-actin為內(nèi)對照，進行PCR擴增。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如下:cyclin G1:F5'-AATGGCCTTAGAATGACTGC-3'R5'-ATGCCAACACAGA

6、TGGCTTT-3'487bp;β-actin: F5'-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3'R5'-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3'300bp。PCR反應(yīng)條件為:94℃變性5分鐘，以94℃30秒、59℃30秒、72℃45秒循環(huán)35次，72℃延伸10分鐘。
　　4、將針對cyclin G1 mRNA5'端編碼區(qū)起始密碼子的ASON通過脂質(zhì)體導(dǎo)入OS-732細胞共同培養(yǎng)后，用Western Blot和RT-P

7、CR分別檢測不同組間cyclinG1蛋白及mRNA的表達， MTT、流式細胞儀及電鏡等方法檢測細胞凋亡。
　　結(jié)果：
　　1、免疫組化結(jié)果:在34例骨肉瘤中，26例表達cyclin G1，陽性表達率76.47％;15例骨軟骨瘤中1例cyclin G1陽性表達。cyclin G1陽性表達與腫瘤分化及是否轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有關(guān)(p＜0.01)。cyclin G1在中、低分化骨肉瘤中陽性表達率較高，而在高分化骨肉瘤中陽性表達率較低(92.3

8、1％、25％);在轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的骨肉瘤中表達率較高(100％)。
　　2、Western Blot和RT-PCR結(jié)果:骨肉瘤組織中cyclin G1蛋白和mRNA表達水平均明顯高于骨軟骨瘤。
　　3、cyclin G1反義脫氧寡核苷酸對OS-732細胞生長的抑制作用及細胞凋亡檢測
　　(1)在倒置相差顯微鏡連續(xù)觀察細胞形態(tài)，反義脫氧寡核苷酸用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對OS-732細胞的生長有明顯抑制作用，從第2天起ASON組的細胞數(shù)較S

9、ON組及空白對照組減少，第3天最為明顯，并且ASON組的細胞數(shù)較其它組細胞生長較分散
　　(2) MTT法測定ASON組細胞抑制率的分析結(jié)果，第一天為(20.195±5.192)％，第二天為(40.660±2.474)％，第三天為(59.260±2.002)％，明顯高于其他組細胞的生長抑制率(P＜0.01)
　　(3)流式細胞儀檢測:根據(jù)DNA含量直方圖分析，經(jīng)cyclin G1 ASON處理的OS-732細胞，其G0/G1

10、期、S期、G2/M期細胞比率與對照組及SON組比較無明顯差異(P＞0.05)，不能說明對細胞增殖有抑制作用。但ASON組的細胞凋亡率為(12.54±0.63)％，對照組和SON組的細胞凋亡率分別為(0.57±0.23)％，(0.71±0.16)％，它們之間有顯著性差異(P＜0.01)
　　(4)電鏡:發(fā)現(xiàn)ASON作用于OS-732細胞后出現(xiàn)典型的凋亡改變:胞漿濃縮，細胞核固縮，染色質(zhì)濃集成團，染色體邊集成月牙狀、塊狀或環(huán)狀，核膜完