細胞周期蛋白G1、G2在喉鱗狀細胞癌中的表達及其臨床意義.pdf

1、目的：本文通過采用CD34抗體標記血管內(nèi)皮細胞，應(yīng)用免疫組化SP法方法研究CD34、CyclinG1、CyclinG2蛋白在喉鱗癌組織中的表達，計算CD34標記的微血管密度(MVD)，并與癌旁正常喉粘膜和喉良性病變組織中的表達作對比分析，評價微血管密度的臨床意義，比較分析MVD與CyclinG1、CyclinG2蛋白之間的關(guān)系，探討CyclinG1、CyclinG2蛋白在喉鱗癌血管生成中的關(guān)系及臨床病理意義，以期為CyclinG1、Cy

2、clinG2在喉鱗癌的診斷、預后和治療中的應(yīng)用，為喉鱗癌綜合治療中的抗血管生成和基因治療研究及應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。 材料： 1.病例選擇 1.1第一部分和第三部分 收集2000年1月～12月間解放軍463醫(yī)院及解放軍總醫(yī)院根治性手術(shù)切除的喉鱗癌標本94例，其中13例因切片或免疫組化過程中出現(xiàn)缺失而排除除外，對81例進行研究，其中解放軍463醫(yī)院71例，解放軍總醫(yī)院10例，所有標本均經(jīng)病理確診

3、為鱗狀細胞癌。其中男71例，女10例：患者年齡36～82歲，平均年齡54.8歲；腫瘤發(fā)生部位：聲門上型18例、聲門型61例、聲門下型2例；病理學分級：I級42例，II級30例，Ⅲ級9例：按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)1997年TNM分期標準進行臨床分期：I期15例，II期24例，III期29例，IV期13例；頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者13例，無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者68例；隨訪過程中復發(fā)21例；術(shù)前未行放療、化療，所有病例均獲訪，隨訪時間>5年。另收集癌旁正

4、常喉粘膜組織塊20例(取材部位距離癌組織2cm以上)及同期門診手術(shù)病例，喉良性病變(10例聲帶息肉，10例聲帶乳頭狀瘤)，均經(jīng)病理確診。 1.2第二部分 收集2000年1月～12月間解放軍463醫(yī)院根治性手術(shù)切除的喉鱗癌新鮮標本40例，所有標本均經(jīng)病理活檢確診為鱗狀細胞癌，其中男31例，女9例；患者年齡39～82歲，平均年齡60.8歲；腫瘤發(fā)生部位：聲門上型10例、聲門型28例、聲門下型2例；病理學分級：I級11例，II

5、級19例，Ⅲ級10例；按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)1997年TNM分期標準進行臨床分期：I期5例，II期11例，III期18例，IV期6例；頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者13例，無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者27例；術(shù)前未行放療、化療。另收集癌旁正常喉粘膜組織塊10例(取材部位距離癌組織2cm以上)和同期門診手術(shù)病例10例，其中喉良性病變(9例聲帶息肉，1例聲帶乳頭狀瘤)，均經(jīng)病理確診。所有新鮮組織液氮速凍后置-70℃低溫冰箱備用。 方法： 1.免疫

6、組化法檢測CyclinG1和CyclinG2蛋白表達及CD34標記的血管內(nèi)皮細胞。 應(yīng)用免疫組化SP法研究，鼠抗人CyclinG1單克隆抗體、兔抗人CyclinG2多克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(SantaCruz公司產(chǎn)品)、鼠抗人CD34單克隆抗體及SP試劑盒均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。實驗步驟按試劑盒說明書進行。以正常血清置換一抗作為空白對照，用已知陽性的乳腺癌組織切片作為陽性對照。CyclinG1陽

7、性物質(zhì)分布在細胞核內(nèi)，呈棕黃色顆粒。CyclinG2陽性物質(zhì)主要分布在細胞胞漿內(nèi)，也有細胞漿、細胞核同時表達或單獨存在細胞核中，呈棕黃色顆粒。CD34染色，內(nèi)皮細胞胞漿，呈棕黃色，參考Weidner的方法計算MVD值。 2.RT-PCR檢測cyclinG1mRNA和cyclinG2mRNA的表達 取50～100mg組織粉末，加人1mlTrizol溶液徹底勻漿。按Trizol試劑盒說明書用一步法提取RNA，用DNA/RNA

8、測定儀測定RNA濃度和純度。所用的cyclinG1的上、下游引物序列分別是：5'-GCCTTTCTCCACAATCCTGA-3'和5'-TGCATTTGTGAAATGGTGGT-3'，擴增片段長度為363bp。所用的cyclinG2的上、下游引物序列分別是：5'-AACCGGACCACAAGAAACTG-3'和5'-ATGACAAGGAGGCCATTCAG-3'，擴增片段長度為324bp。內(nèi)對照β-actin的上、下游引物序列分別是：5

9、'-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3'和5'-CACCTTCACCGTTCCAGTT-3'，擴增片段長度為511bp。PCR的反應(yīng)體系為：3μl標本cDNA，10×Buffer2.5μl，2.5mmol/LdNTPs2μl，cyclinG1或(cyclinG2)引物(終濃度50pmol/L)和β-actin引物(終濃度10pmol/L)各4μl，Taq酶(5U/μl)0.2μl，滅菌蒸餾水補足25μl。PCR反應(yīng)程序為：94

10、℃預變性2分鐘，94℃變性30秒，55℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，30個循環(huán)結(jié)束。PCR產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠顯色。使用BandLeaderVer.3.0圖象分析軟件對電泳條帶進行灰度掃描，計算cyclinG與β-actin產(chǎn)物條帶的灰度值比值，計算cyclinG表達的相對值。 統(tǒng)計學處理： 選用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料用x2檢驗、Fisher(Fisher'sexacttest)

11、檢驗進行統(tǒng)計分析。計量資料均采用x±SD表示，兩組均數(shù)比較時采用獨立t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析進行統(tǒng)計分析。生存分析采用Kaplan-Meier法。 實驗結(jié)果： 1)喉鱗癌組織，喉良性病變，癌旁正常喉粘膜組織中CyclinG1陽性表達率分別為61.7％(50/81)、5％(1/20)、0％(0/20)，CyclinG1的表達與喉良性病變、癌旁正常喉粘膜組織相比，其差別具有顯著性(P=0.000)。 2

12、)CyclinG1在喉鱗癌組織中表達與腫瘤分化程度、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及復發(fā)均有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.007、0.013和0.035)。 3)CyclinG2在喉鱗癌，喉良性病變和癌旁正常喉粘膜組織表達陽性率分別為67.9％、90％、100％，差異具有顯著性(P=0.001)。 4)CyclinG2在喉鱗癌中陽性表達率隨分化程度的降低而降低，有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率分別為38.4％和73.5％，差異具有顯著性(P值分別為

13、0.033和0.013)。 5)CyclinG1mRNA的表達強度在喉鱗癌組織中明顯高于癌旁正常喉粘膜及喉良性病變組(P=0.000)。中-低分化與高分化喉鱗癌比較，后者cyclinGlmRNA表達較低，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.001)。 6)CyclinG1mRNA在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組喉鱗癌的表達強度顯著增高(P=0.000)。cyclinG1mRNA的表達與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與患者年齡、性別、臨床分期、

14、臨床分型等均無統(tǒng)計學意義。 7)CyclinG2mRNA在喉鱗癌組織中、癌旁正常喉粘膜組織、喉良性病變中表達強度分別為(0.65±0.13)、(0.94±0.11)、(0.91±0.14)。中-低分化與高分化喉鱗癌比較，后者cyclinG2表達較強，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。 8)CyclinG2mRNA表達與患者年齡、性別、臨床分期、臨床分型等均無統(tǒng)計學意義，而cyclinG2基因在淋巴結(jié)陰性者表達強度為(

15、0.69±0.11)，陽性者為(0.57±0.12)，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P=0.004)。 9)喉鱗癌，喉良性病變和癌旁正常喉粘膜組織MVD分別為(44.88±15.11)mv，(5.30±1.03)mv和(4.70±1.30)mv，喉鱗癌與喉良性病變和癌旁正常喉粘膜組織MVD相比，差異具有顯著性(P=0.000)； 10)CyclinG1蛋白表達陽性組MVD為(53.34±12.53)mv，陰性組為(30.74±3

16、.49)mv，其差別具有顯著性(P=0.000)。 11)CyclinG2蛋白表達陽性組MVD為(39.53±9.93)mv，陰性組為(55.62±17.82)mv，其差別具有顯著性(P=0.000)。 結(jié)論： 1)CyelinG1蛋白在喉鱗癌中存在高表達，并與腫瘤分化程度、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，CyclinG1蛋白異常表達可能在喉鱗癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，并可能作為判斷患者預后的指標之一。

17、 2)CyclinG2蛋白表達強度與喉鱗癌的惡性程度及發(fā)展趨勢明顯負相關(guān)，并與MVD關(guān)系密切。 3)CyclinG1mRNA在喉鱗癌組織中有異常高表達，并與喉鱗癌發(fā)生發(fā)展有一定聯(lián)系，其高表達可能是喉鱗癌預后不良的因素之一。 4)CyclinG2mRNA表達強度與喉鱗癌的惡性程度及發(fā)展趨勢明顯負相關(guān)，可作為預測喉鱗癌預后的生物學指標之一。 5)免疫組化實驗及RT-PCR實驗結(jié)果具有一致性，由于免疫組化方法對實驗設(shè)