Survivin在腎癌組織中的表達及Survivin反義寡核苷酸誘導腎癌細胞凋亡及機制的研究.pdf

1、腫瘤是一類細胞增殖周期紊亂性疾病，細胞增殖和凋亡的失衡可以導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，對細胞周期的調控在腫瘤的發(fā)生和治療中起重要作用。不可控制的細胞增殖是癌癥的特征。惡性腫瘤的增殖從生物學角度看主要表現(xiàn)在兩個方面：一方面是腫瘤細胞的“不滅性”，即凋亡障礙；另一方面是細胞分裂的失控，即細胞周期網絡調控系統(tǒng)的障礙。Survivin是近來分離的哺乳動物凋亡抑制劑，具有與其他凋亡基因不一樣的特性，即在良好分化的正常組織中不表達，但是廣泛表達于各種腫瘤

2、組織。它在腫瘤中高表達反映了凋亡抑制在腫瘤進展中的作用，而它在有絲分裂中的作用引起了人們對于細胞增殖和細胞凋亡的興趣。 目的通過免疫組化和RT-PCR方法檢測了Survivin在腎癌組織和腎癌細胞系中的表達情況，通過反義寡核苷酸技術，觀察了其對腎癌細胞凋亡的影響，探討其對腫瘤細胞影響的途徑。 方法：(1)應用免疫組化方法檢測66例腎癌患者和20例正常腎組織中Survivin的表達情況，應用RT-PCR和Westernbl

3、ot檢測6例腎癌組織，6例正常腎組織及兩種腎癌細胞系786-0和ACHN中SurvivinmRNA的表達情況。(2)通過脂質體介導的Survivin反義寡核苷酸技術，采用電鏡，免疫組化，westernblot，RT-PCR和流式細胞儀等手段，觀察Survivin反義寡核苷酸對腎癌細胞凋亡、增殖的影響。 結果： (1)66例腎癌組織均有不同程度的Survivin表達，主要表達于細胞的胞漿和細胞膜，為淺黃色和棕黃色。20例正

4、常腎組織很少見到Survivin蛋白的表達。腎癌組織和正常腎組織吸光度分別為0.031±0.002和0.875±0.124，兩者比較，差異具有顯著性意義(p＜0.01)。不同病理類型透明細胞癌，嗜色細胞癌和嫌色細胞癌吸光度值分別為0.873±0.091，0.904±0.103和0.813±0.126，各類型間差異無顯著性意義。不同病理分級腎癌組織G1，G2，G3和G4吸光度值分別為0.693±0.092，0.762±0113，0.876

5、±0.106和0.903±0.092，各級間比較，差異具有顯著性意義(p＜0.05)。不同腎癌臨床分期Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ、Ⅳ吸光度值分別為0.864±0.121，0.884±0.093和0.853±0.106，各期間比較，差異無顯著性意義。Westernblot和RT-PCR檢測結果顯示，正常腎組織表達陰性，腎癌組織和兩種腎癌細胞系786-0和ACHN均有不同程度的Survivin蛋白和mRNA表達，統(tǒng)計學表明差異有顯著性意義。 (2)

6、SurvivinASODN轉染后腎癌細胞超微結構的變化：轉染結束后可見細胞皺縮，細胞膜微絨毛消失，染色質濃縮，致密的凋亡小體亦較多。免疫細胞化學染色顯示survivn蛋白陽性顆粒定位于細胞質，呈淡黃至棕黃色染色；空白對照組和SODN組染色較強，而ASODN組明顯減弱。各組細胞均有不同程度的特異性Survivin基因條帶表達，空白對照組和正義對照組表達最強，而ASODN組表達相對較弱。RT-PCR結果與空白對照組和正義對照組相比，ASOD

7、N組表達明顯下調(P＜0.05)。Westernblot結果也顯示，與空白對照組和SODNSurvivin蛋白表達水平相比較，ASODN組表達亦明顯下調，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。流式細胞儀定量檢測凋亡細胞，DNA直方圖可見轉染后二倍體峰(G1期細胞)減少，G1峰左側出現(xiàn)明顯的凋亡峰(亞二倍體峰)，G2/M期呈明顯增加趨勢。各組細胞凋亡分別為6.05±0.48％，5.70±041％，10.54±0.72％，12.80±0.38

8、％，22.30±1.23％，三組實驗組細胞凋亡均較對照組有顯著增加。ASODN對細胞凋亡的影響呈濃度依賴關系。經MTT法檢測，800ng/mlASODN作用24h，48h和72h后，腎癌細胞抑制率分別為38.5±2.6％，52.9±3.4％和62.2±3.8％，呈現(xiàn)時間依賴關系，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 結論： (1)本研究應用免疫組化的方法在66例腎癌組織和20例正常腎組織檢測發(fā)現(xiàn)，正常腎組織不表達Surv

9、ivin，而腎癌組織不同程度表達Survivin蛋白，表明Survivin和腎癌的發(fā)生有關。 (2)本研究表明，不同病理類型，不同臨床分期間，Survivin的表達差異無顯著性意義，Survivin的表達隨著分化程度的降低而增高，說明Survivin表達和腎癌的分化程度有關，和腎癌的發(fā)展有關，可以用來作為判斷腫瘤預后的標志物。 (3)本實驗利用反義技術，合成并轉染靶向Survivin的反義寡核苷酸，結果表明轉染成功后，腎

10、癌細胞系786-0中SurvivinmRNA和蛋白的表達呈現(xiàn)下降趨勢。提示可以通過Survivin途徑治療腎癌。 (4)本實驗表明Survivin的反義寡核苷酸對腎癌細胞的抑制效應呈現(xiàn)劑量-時間依賴效應，進一步證實了Survivin的反義寡核苷酸治療腎癌的有效性。 (5)Survivin的反義寡核苷酸通過封閉Survivin的表達，誘導腎癌細胞的生長停滯于G2/M期，使之無法完成有絲分裂，從而抑制腎癌細胞的增殖活性。