整合素β-,1-反義寡核苷酸治療胰腺癌的實驗研究.pdf

1、本研究包括以下幾個方面：采用免疫組織化學方法分析胰腺癌組織中整合素β1表達與臨床病理特征的關(guān)系；將靶向整合素β1的ASODN通過脂質(zhì)體導入到人胰腺癌BXPC-3細胞中，觀察其對整合素β1mRNA和蛋白表達的抑制作用，研究胰腺癌細胞體外侵襲力改變；轉(zhuǎn)染整合素β1mRNAASODN后觀察細胞生長、凋亡和化療敏感性的改變；通過建立裸鼠人胰腺癌皮下移植瘤模型，進一步觀察整合素β1ASODN在體內(nèi)的抑瘤效果和對靶基因表達的影響。 第一部分

2、整合素β1、蛋白激酶Cα在胰腺癌中的表達及其意義 目的 探討整合素β1和蛋白激酶Cα(proteinkinaseC，PKCα)在胰腺癌中的表達及其臨床意義。 方法 采用免疫組織化學S-P方法，檢測56例胰腺癌及23例癌旁非腫瘤胰腺組織中整合素β1和PKCα的表達，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系。 結(jié)果 1.整合素β1胰腺癌組織和癌旁非腫瘤胰腺組織中高表達率分別為71.43％和43.48％，兩

3、者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；PKCα在胰腺癌組織和癌旁非腫瘤胰腺組織高表達率分別為62.50％和21.74％，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 2.整合素β1高表達與胰腺癌TNM分期(P＜0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.05)有關(guān)。 3.PKCα高表達與胰腺癌分化程度(P＜0.05)、TNM分期(P＜0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)。 4.在胰腺癌組織中，整合素β1表達與PKCα表達呈正相

4、關(guān)(r=0.653，P＜0.05)。結(jié)論 1.整合素β1和PKCα的表達和/或功能異?？赡芄餐瑓⑴c胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。 2.聯(lián)合檢測兩種蛋白對于預測胰腺癌轉(zhuǎn)移潛能具有一定參考價值。 第二部分整合素β1反義寡核苷酸對人胰腺癌細胞體外侵襲力的影響 目的 觀察整合素β1反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotides，ASODN)對人胰腺癌BXPC-3細胞體外侵襲力的影響。

5、 方法 采用脂質(zhì)體將整合素β1ASODN轉(zhuǎn)染到人胰腺癌BXPC-3細胞中，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(reversetranscript-polymerasechainreaction，RT-PCR)、Western印跡法和Transwell侵襲室方法分別檢測細胞整合素β1mRNA、蛋白表達水平及體外侵襲能力。 結(jié)果 1.與對照組相比，32mg/L～128mg/LASODN轉(zhuǎn)染后可抑制整合素β1mRNA和蛋白的表達，其

6、中64mg/L和128mg/LASODN對整合素β1mRNA和蛋白的表達有非常顯著的抑制作用(P＜0.01)。 2.體外侵襲力檢測顯示，64mg/L整合素β1ASODN轉(zhuǎn)染后使胰腺癌細胞侵襲能力明顯下降。 結(jié)論 1.靶向整合素β1的ASODN可有效阻斷其在人胰腺癌細胞中的表達。 2.靶向整合素β1的ASODN可降低胰腺癌細胞體外侵襲力。 第三部分整合素β1反義寡核苷酸對人胰腺癌細胞生長、凋亡和化療

7、敏感性的影響 目的 觀察整合素β1反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotides，ASODN)對人胰腺癌BXPC-3細胞生長、凋亡和對化療藥物敏感性的影響。 方法 采用脂質(zhì)體將整合素β1ASODN轉(zhuǎn)染到人胰腺癌BXPC-3細胞中，MTT法檢測細胞相對存活率，AnnexinV-FITC/PI染色檢測細胞凋亡。以有效轉(zhuǎn)染濃度轉(zhuǎn)染整合素β1ASODN24小時，給予梯度濃度5-氟尿嘧啶

8、、阿霉素和健擇，觀察量效關(guān)系，計算半數(shù)抑制濃度(inhibitoryconcentration50％，IC50)。 結(jié)果 1.與對照組相比，32mg/L～128mg/LASODN轉(zhuǎn)染后可抑制胰腺癌細胞的生長，且呈量效依賴關(guān)系，64mg/L和128mg/L抑制作用最明顯。 2.轉(zhuǎn)染64mg/L整合素β1ASODN24h，細胞早期凋亡率為20.17±2.04％。 3.轉(zhuǎn)染整合素β1ASODN增加胰腺癌細胞對化

9、療藥物的敏感性，ASODN+化療組對各化療藥物的IC50均有顯著下降。 結(jié)論 1.靶向整合素β1的ASODN可有效抑制胰腺癌細胞生長。 2.靶向整合素β1的ASODN可誘導胰腺癌細胞早期凋亡。 3.靶向整合素β1的ASODN可增強胰腺癌細胞對化療藥物敏感性。 第四部分整合素β1反義寡核苷酸對人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的治療作用 目的 觀察整合素β1反義寡核苷酸(antisenseoli

10、godeoxynucleotides，ASODN)對裸鼠人胰腺癌移植瘤生長和基因表達的抑制作用。 方法 建立裸鼠人胰腺癌皮下移植瘤模型，隨機分為三組給予不同條件處理：對照組(皮下注射脂質(zhì)體和轉(zhuǎn)染液)，隨機序列(randomoligodeoxynucleotides，RODN)治療組(皮下注射RODN、脂質(zhì)體和轉(zhuǎn)染液)，ASODN治療組(皮下注射ASODN、脂質(zhì)體和轉(zhuǎn)染液)。治療期間定期測腫瘤體積和裸鼠體重，計算抑瘤率和腫

11、瘤縮小率。采用RT-PCR和Western印跡法檢測治療后裸鼠腫瘤組織中整合素β1mRNA和蛋白表達情況。 結(jié)果 1.治療結(jié)束后，ASODN治療組、RODN治療組和對照組平均腫瘤體積分別為202.82±2.23mm3、702.34±11.64mm3和712.98±16.82mm3，ASODN治療組與對照組比較差有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，而RODN治療組和對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。ASODN治療組、R

12、ODN治療組抑瘤率分別為1.49％和71.55％，ASODN治療組腫瘤縮小15.36％。各組裸鼠體重變化無明顯差別。 2.與對照組比較，ASODN治療組裸鼠腫瘤組織中整合素β1mRNA和蛋白表達水平明顯降低(P＜0.01)。 結(jié)論 1靶向整合素β1的ASODN可在體內(nèi)抑制mRNA和蛋白表達。 2靶向整合β1的ASODN對人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生長具有一定抑制作用。 3整合素β1ASODN成為一種