基質金屬蛋白酶-9反義寡核苷酸對肺腺癌細胞靶向治療的實驗研究.pdf

1、背景:目前，肺癌已居人類腫瘤致死的第一名，全世界泛圍內，科學家們一直積極采用各種方法來治療肺癌，但治療效果不能令人滿意，肺癌總的治愈率仍不足14％。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，人類對肺癌的發(fā)生發(fā)展轉移的分子機制有了更深的認識?；蛑委熞殉蔀橐环N極具前景的新方法。反義脫氧寡核苷酸(ASODN)是一段與mRNA或DNA特異性結合，并阻斷其表達的人工合成分子。ASODN可封閉或抑制腫瘤細胞關鍵編碼基因，從而特異性抑制腫瘤細胞的增殖。 反

2、義藥物是以反義核酸技術為基礎開發(fā)的，以治療為目的，安全有效的新型藥物。近年來，隨著對反義寡核苷酸及其結構衍生物如硫代磷酸寡聚脫氧核苷酸反義機理的闡明，大量以病毒，癌基因，細胞活性因子及其它疾病相關蛋白為靶點的反義藥物相繼進入臨床試驗階段，使反義藥物的研究再次進入蓬勃發(fā)展時期。 基質金屬蛋白酶家族(MMPs)是一組重要的含鋅離子的細胞外基質(ECM)降解酶。目前已鑒定出約20多種MMPs，基質金屬蛋白酶-9是其中重要的一組酶，可在

3、許多腫瘤組織中表達。還在腫瘤的凋亡，侵襲和轉移中起著關鍵性作用。 本研究采用人肺腺癌A549細胞株，運用脂質體介導的NdP-9ASODN轉染該細胞，通過MTT法檢測MMP-9ASODN轉染對A549細胞生長的影響；RT-PCR觀察MMP-9mRNA蛋白的表達：Western blot檢測MMP-9蛋白的改變；流式細胞術檢測MMP-9ASODN對A549細胞增殖和凋亡比率；MTT比色法和劃痕遷移試驗觀察MMP-9ASODN對A54

4、9細胞體外粘附以及遷移的能力；最后觀察MMP-9ASODN的體內抑瘤效果，進而為肺癌的基因治療提供一種新方法。肺癌靶向治療藥物的研究已進入開發(fā)階段，目前有眾多的反義藥物已進入臨床實驗階段。本研究旨在證明反義寡核苷酸MMP-9轉染A549細胞后，可抑制腫瘤細胞生長，并誘導其凋亡，從而為肺癌的反義基因治療提供了可靠的實驗依據(jù)。 方法: 1．脂質體介導的寡核苷酸轉染A549細胞人肺腺癌A549細胞在1640完全培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)

5、，進入對數(shù)生長期后接種于96孔板，分四組進行實驗，即MMP-9ASODN，MMP-9SODN，脂質體組和空白對照組，轉染后24h以熒光倒置顯微鏡觀察，隨機選取5個高倍鏡視野，計數(shù)全部細胞數(shù)和發(fā)綠色熒光細胞數(shù)，計算轉染率。 2．MTT法檢測MMP-9ASODN轉染對A549細胞生長的影響ASODN轉染組加設不同濃度組即200nmol/L，400nmol/L，600nmol/L和800nmol/L的ASODN轉染。每組設3個復孔，分

6、別于轉染0 h，4h，8h，12h，24h，48h，60h后行MTT實驗。酶標儀上測定波長為570nm，計算A549細胞的存活率。 3．流式細胞術檢測細胞增殖和凋亡比率收集經(jīng)處理后的各組細胞于離心管內，離心，洗滌，固定，染色，置流式細胞儀上，在激發(fā)波長為488nm處進行檢測，計算細胞凋亡比率。 4．RT-PCR法檢測MMP-9mRNA的表達轉染后收集各組細胞，進行RNA提取，定量后以其為模板逆轉錄合成cDNA鏈，然后用引

7、物進行PCR擴增，產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。 5．Western blot檢測MMP-9蛋白的改變收集轉染24h細胞提取細胞中總蛋白，測定出樣品的蛋白質含量，然后將蛋白質在不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，染色，轉膜觀察結果。 6．MMP-9ASODN轉染對A549細胞體外粘附及體外遷移的影響檢測包被及水化基底膜，接種及培養(yǎng)細胞，然后MTT比色法檢測，計算細胞粘附率。同樣包被及水化基底膜，制備培養(yǎng)單層細胞，用人工劃痕法，在相

8、差顯微鏡下隨機選擇5個100×視野內計算遷移到劃痕空隙中的細胞總數(shù)。 7．裸鼠模型抑瘤率觀察構建移植瘤裸鼠模型后，MMP-9ASODN直接移植瘤內注射，觀察其抗移植瘤生長效應，包括一般狀況，局部實體瘤生長抑制率的測定以及病理組織學檢測。 結論: 1．MMP-9ASODN能夠有效地抑制肺癌A549細胞的體外增殖，作用方式呈時間及濃度依賴性。 2． MMP-9ASODN能夠下調MMP-9mRNA和MMP-9蛋