慢病毒介導(dǎo)NIBP基因沉默對人結(jié)腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響.pdf

1、目的：通過研究慢病毒介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子-κB誘導(dǎo)激酶和IκB激酶連接蛋白(NIK and IKKβbinding protein，NIBP)基因沉默后對人結(jié)腸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響，初步探討NIBP與結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以及可能涉及的機制。
　　方法：利用DNA重組技術(shù)，進(jìn)行設(shè)計并構(gòu)建人NIBP基因的Lenti-EGFP-NIBP-miR慢病毒載體，以及無關(guān)序列的Lenti-EGFP慢病毒載體感染人結(jié)腸癌HCT1

2、16細(xì)胞株，并用殺稻瘟菌素(blasticidin，BSD)進(jìn)行篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染低表達(dá)NIBP的單克隆HCT116細(xì)胞，分別為轉(zhuǎn)染組(NIBP-RNAi組)和陰性對照組(NC組)，而未予轉(zhuǎn)染處理的HCT116細(xì)胞則為空白對照組(CON組)。將實驗分為非TNF-α組和TNF-α組兩大組，非TNF-α組包括轉(zhuǎn)染組(NIBP-RNAi)、陰性對照組(NC)、空白對照組(CON)，TNF-α組包括轉(zhuǎn)染組+TNF-α(NIBP-RNAi+)、陰性對照

3、組+TNF-α(NC+)、空白對照組+TNF-α(CON+)，根據(jù)文獻(xiàn)及本課題組先前的實驗結(jié)果，TNF-α組均予終濃度為20 ng/ml的NF-κB活化激活劑TNF-α進(jìn)行干預(yù)。應(yīng)用實時熒光定量-PCR及Western Blot技術(shù)檢測非TNF-α組 NIBP mRNA及蛋白的表達(dá)情況以及各組細(xì)胞中E-cadherin與N-cadherin的表達(dá)；采用倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　結(jié)果：倒置熒光顯微鏡下可見NIBP-

4、RNAi組及NC組有大量的綠色熒光蛋白。實時熒光定量-PCR及Western Blot均顯示NIBP-RNAi組NIBP的表達(dá)均顯著低于NC組及CON組(P<0.05)。實時熒光定量-PCR結(jié)果顯示，各組E-cadherin mRNA的相對表達(dá)量為：NIBP-RNAi組(8.12±0.50)和NIBP-RNAi+組(4.11±1.65)均高于CON組(1.00±0.00)和NC組(1.04±0.05)(P<0.05)，而CON+組(0.

5、30±0.13)和NC+組(0.32±0.10)則明顯低于CON組和NC組(P<0.05)；各組N-cadherin mRNA的相對表達(dá)量為：NIBP-RNAi組(0.18±0.08)和NIBP-RNAi+組(0.48±0.18)均低于CON組(1.00±0.00)和NC組(0.94±0.03)(P<0.05)，CON+組(6.55±2.31)和NC+組(7.26±2.20)均高于CON組和NC組(P<0.05)。Western Blo

6、t結(jié)果顯示，各組的E-cadherin的蛋白表達(dá)量分別是：NIBP-RNAi組(1.30±0.11)和NIBP-RNAi+組(0.64±0.01)高于CON組(0.37±0.01)和NC組(0.34±0.02)(P<0.05)，CON+組(0.18±0.02)和NC+組(0.18±0.01)均低于CON組和NC組(P<0.05)；各組的N-cadherin的蛋白表達(dá)量為：NIBP-RNAi組(0.18±0.06)和NIBP-RNAi+組

7、(0.34±0.01)均低于CON組(0.56±0.05)和NC組(0.47±0.13)(P<0.05)，而CON+組(0.67±0.06)和NC+組(0.68±0.03)均高于CON組和NC組(P<0.05)。綜上可知，與CON組比較，CON+組、NC+組細(xì)胞的E-cadherin的mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯降低、N-cadherin的mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯上升(P<0.05)，NIBP-RNAi組及NIBP-RNAi+組細(xì)胞的E

8、-cadherin的mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯上升、N-cadherin的mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而CON組和NC組比較，以及CON+組和NC+組比較，E-cadherin、N-cadherin的mRNA和蛋白的表達(dá)差異均無統(tǒng)計意義(P>0.05)。經(jīng)倒置相差顯微鏡可觀察到CON+組、NC+組的細(xì)胞較CON組和NC組的細(xì)胞而言明顯發(fā)生EMT變化，表現(xiàn)為細(xì)胞細(xì)長的絲狀偽足增多，細(xì)胞間排列更疏松；N