間充質(zhì)干細(xì)胞對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW4810上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及可能機制的體外研究.pdf

1、目的:本實驗通過間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)體外作用于人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞,觀察其上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymaltransition,EMT)的相關(guān)蛋白表達改變情況,研究MSC對SW480細(xì)胞內(nèi)信號蛋白/β-連環(huán)素(Wnt/β-catentin),信號通路的調(diào)控作用和對此通路相關(guān)靶基因基質(zhì)金屬蛋白酶-7(MMP-7),環(huán)氧化酶-2(COX-2),β-catentin

2、的影響,探討間充質(zhì)干細(xì)胞對人結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及可能機制,為臨床應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞治療結(jié)腸癌提供理論依據(jù)。
　　 方法:選取臍帶血來源間充質(zhì)干細(xì)胞,人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞進行體外培養(yǎng),收集3-8代間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)上清液。將SW480細(xì)胞設(shè)立對照組與實驗組,對照組細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),實驗組細(xì)胞分別用含20％、40％、80％濃度間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。1、采用MTT方法檢測各實驗組SW480細(xì)胞的抑制率,

3、篩選受影響最明顯時間;2、采用劃痕實驗法觀察48小時內(nèi)各組劃痕愈合程度;3、流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)分別定量測定48小時后對照組及各實驗組人SW480細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志蛋白E-鈣黏著蛋白(E-cad)、N-鈣黏著蛋白(N-cad)表達的變化。結(jié)合劃痕實驗及FCM結(jié)果篩選作用最明顯濃度組;4、應(yīng)用FCM檢測40％濃度MSC上清液培養(yǎng)人SW480細(xì)胞48小時后Wnt/β-catentin信號通路下游靶基因MMP

4、-7,COX-2表達情況。5、采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(revers transcription PCR,RT-PCR)法驗證40％實驗組SW480細(xì)胞48小時后MMP-7,COX-2的表達改變,并檢測上游基因β-catentin表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 1 MTT結(jié)果顯示:與對照組相比,各實驗組培養(yǎng)24h后測得的抑制率分別為(47.0±8.3)％、(72.4±4.8)％、(78,3±4.7)％,與對照組相比均具有

5、統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),且各實驗組之間兩兩相比也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。于24h、48h、72h檢測實驗組抑制率,20％實驗組抑制率由(47.0±8.3)％升至(56.0±3.8)％,40％實驗組由(72.4±4.8)％升至(91.0±5.1)％,80％實驗組由(78.3±4.7)％升至(93.3±4.9)％,均逐漸增高。各實驗組組間相比48h與24h具有極顯著性差異(P＜0.01),而各實驗組在誘導(dǎo)72h后與48h相比抑制

6、率無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。MTT實驗結(jié)果:各實驗組在作用48h時抑制效果最為顯著。
　　 2劃痕實驗結(jié)果顯示:光鏡下顯示,MSC作用48h后,與對照組相比,不同濃度實驗組SW480細(xì)胞遷移均減緩,對照組劃痕較各實驗組劃痕明顯變細(xì)。劃痕寬度:對照組＜20％組＜40％組=80％組。說明MSC對SW480細(xì)胞遷移有一定抑制作用,且40％,80％實驗組劃痕在各時間點劃痕寬度無明顯改變。
　　 3 FCM測定E-cad、

7、N-cad表達結(jié)果顯示:不同濃度MSC上清液與SW480細(xì)胞培養(yǎng)48h可使SW480細(xì)胞E-cad表達呈上升趨勢、N-cad表達呈下降趨勢,符合腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程受到抑制時的分子表現(xiàn)。E-cad表達由1升至1.148,N-cad表達由1降至0.977,均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。20％實驗組與其它實驗組組間具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),但40％濃度組與80％濃度組之間無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。提示40％濃度組對S

8、W480細(xì)胞影響最為顯著。
　　 4 FCM法檢測加入40％MSC上清液實驗組與對照組相比,48小時后SW480細(xì)胞中MMP-7蛋白表達由1降至0.965±0.007,COX-2蛋白表達由1降至0.89±0.0035,二者均具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 5 RT-PCR檢測結(jié)果表明:含40％濃度MSC上清液培養(yǎng)液誘導(dǎo)SW480細(xì)胞48h后,與對照組相比,實驗組SW480細(xì)胞中MMP-7的相對表達量由0.842降

9、至0.19,COX-2的相對表達量由0.558降至0.165,β-catentin的相對表達量由0.660降至0.215,mRNA表達均呈下降趨勢,且與對照組相比均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1本研究通過體外實驗證實MSC可以抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移,主要與MSC抑制SW480細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān),為治療腫瘤開辟了一條具有潛力的途徑。
　　 2進一步研究提示MSC抑制上皮