自分泌Galectin-3活化的巨噬細(xì)胞促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化.pdf

1、研究背景與目的：
　　結(jié)腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移是致使晚期結(jié)腸癌患者預(yù)后不良和導(dǎo)致死亡的主要原因之一。結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制一直是科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）學(xué)說在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的多種假說中較為熱門。該假說提出腫瘤細(xì)胞EMT后，侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。近年，腫瘤微環(huán)境在腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中的作用日益受到重視。巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中浸潤較早，數(shù)目較多

2、的免疫細(xì)胞，也是微環(huán)境中細(xì)胞因子的主要來源。巨噬細(xì)胞可塑性強(qiáng)，在不同的細(xì)胞因子作用下可以分化為不同的亞型。不同類型的巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的作用不同。單核細(xì)胞定值于巨噬細(xì)胞后，分化成為未活化的巨噬細(xì)胞M0,根據(jù)其活化途徑的不同，巨噬細(xì)胞可以分為兩大類：M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞發(fā)揮誘發(fā)炎癥反應(yīng)、吞噬并殺傷腫瘤細(xì)胞的作用；M2亞型巨噬細(xì)胞則主要抑制炎癥反應(yīng)，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管新生。以腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞為主要代表的

3、腫瘤微環(huán)境也參與了促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的過程。微環(huán)境中的多種細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變，而腫瘤細(xì)胞反過來亦可對其所處的微環(huán)境進(jìn)行調(diào)控，以適應(yīng)自身生存。這其中涉及多種細(xì)胞成分以及細(xì)胞因子，是一個龐大而復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中的具體機(jī)制至今仍尚未探明。
　　S100A8是鈣離子結(jié)合蛋白S100家族的成員，是一種急性反應(yīng)蛋白。大量的研究證實(shí)其作為一種“損傷模式蛋白”，在機(jī)體受到侵害的早期即出現(xiàn)表達(dá)升高。在我們前期的實(shí)驗中發(fā)

4、現(xiàn)，炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌小鼠模型中，S100A8的表達(dá)增高早于Galectin-3(Gal-3)，且S100A8可以激活巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路和PI3K/AKT通路，產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，影響結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。
　　Galectin-3（Gal-3）是半乳糖凝集素家族成員，廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)，并可以分泌到細(xì)胞外基質(zhì)。在細(xì)胞外，Gal-3可以通過與各種免疫細(xì)胞表面的聚糖結(jié)合，發(fā)揮刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生、促進(jìn)細(xì)胞

5、粘附、影響細(xì)胞趨化以及凋亡的作用。在細(xì)胞內(nèi)Gal-3可以通過參與信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞各種生物反應(yīng)?？梢奊al-3對腫瘤微環(huán)境及腫瘤細(xì)胞本身均有一定的作用。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)Gal-3高表達(dá)于結(jié)腸癌腫瘤組織和結(jié)腸癌腫瘤間質(zhì)，與結(jié)腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但Galectin-3發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚未探明。在本研究中，我們對Gal-3在結(jié)腸癌中高表達(dá)的機(jī)制以及其高表達(dá)后對腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞又會產(chǎn)生什么影響進(jìn)行了初步研究。<

6、br>　　研究方法：
　?。?）通過將THP-1細(xì)胞予Phorbol-12-myristat-13-acetate(PMA)體外誘導(dǎo)的方法，使其分化成為M0型巨噬細(xì)胞，用外源性S100A8重組蛋白刺激巨噬細(xì)胞24h后，分別收集細(xì)胞總蛋白和培養(yǎng)上清，采用westenblot和ELISA的方法分別檢測阻斷STAT3/IL-6信號通路前后IL-6、Gal-3的表達(dá)和STAT3磷酸化水平；分析微環(huán)境中S100A8對巨噬細(xì)胞分泌Gal-3的

7、調(diào)節(jié)及其機(jī)制。
　?。?）同樣將THP-1細(xì)胞體外用PMA誘導(dǎo)成為M0型巨噬細(xì)胞，用Gal-3刺激3h、6h、12h、24h、48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用ELISA方法檢測細(xì)胞因子IL-6、IL-12、INF-γ、IL-10、TGF-β表達(dá)改變，并與LPS誘導(dǎo)成為的M1型巨噬細(xì)胞和IL-4誘導(dǎo)成為的M2型巨噬細(xì)胞進(jìn)行比較，檢測其細(xì)胞因子表達(dá)的特點(diǎn)；收集Gal-3刺激24小時后的巨噬細(xì)胞，流式細(xì)胞技術(shù)檢測單核巨噬細(xì)胞表面特異性標(biāo)

8、志物CD68和M2型巨噬細(xì)胞特異性表面分子CD163的表達(dá)，分析Gal-3對巨噬細(xì)胞分化的影響。
　　（3）收集外源性Gal-3重組蛋白刺激巨噬細(xì)胞24h后的培養(yǎng)上清，與結(jié)腸癌細(xì)胞SW480共培養(yǎng)，觀察SW480細(xì)胞24h、48h時形態(tài)改變，劃痕實(shí)驗測其遷移能力改變，trsanswell法測其侵襲力變化，westenblot方法測SW480細(xì)胞EMT相關(guān)分子E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Twist的

9、表達(dá)，探究經(jīng)Gal-3刺激后的巨噬細(xì)胞對結(jié)直腸癌EMT、侵襲、遷移能力的影響。
　　（4）收集共培養(yǎng)后結(jié)腸癌細(xì)胞上清，檢測上清中CCL20、CXCL5的表達(dá)變化分析微環(huán)境中巨噬細(xì)胞對結(jié)腸癌細(xì)胞趨化其他免疫細(xì)胞的能力可能存在的影響。
　　實(shí)驗結(jié)果：
　?。?）Westenblot和ELISA結(jié)果均顯示外源性S100A8蛋白刺激后的巨噬細(xì)胞中及培養(yǎng)上清中Gal-3的表達(dá)較未處理的巨噬細(xì)胞明顯升高，IL-6的表達(dá)和STAT3

10、磷酸化水平（p-STAT3）顯著升高，與未處理的巨噬細(xì)胞相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。抑制STAT3通路活性后，使用同等劑量外源性S100A8重組蛋白刺激巨噬細(xì)胞，Gal-3的表達(dá)與單獨(dú)應(yīng)用S100A8刺激組相比較明顯下調(diào)，但與對照組比較仍有上調(diào)。
　?。?）流式細(xì)胞實(shí)驗結(jié)果顯示Gal-3刺激后的巨噬細(xì)胞CD163表達(dá)增高，CD68(+)CD163(+)細(xì)胞比例增加，但作用沒有IL-4誘導(dǎo)組顯著。ELISA結(jié)果顯示Ga

11、l-3刺激后的巨噬細(xì)胞上清中IL-10、TGF-β、IL-6明顯升高（P<0.05），IFN-γ、IL-12雖較對照組有所升高，但與IL-4刺激組相比較未見明顯差異（P>0.05）。Gal-3誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的表達(dá)更接近于IL-4誘導(dǎo)分化的M2型巨噬細(xì)胞。
　?。?）Gal-3刺激后巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基與結(jié)腸癌細(xì)胞SW480共培養(yǎng)可誘導(dǎo)SW480細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)改變，由橢圓形變?yōu)樗笮巍⒓?xì)胞體積增大、細(xì)胞間隙增寬，出現(xiàn)間質(zhì)化

12、改變。Transwell實(shí)驗結(jié)果顯示共培養(yǎng)后的SW480細(xì)胞穿過基質(zhì)膠透過小室膜的細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組（P<0.05）。劃痕實(shí)驗中共培養(yǎng)之后的SW480細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng),Western blot檢測共培養(yǎng)后SW480細(xì)胞總蛋白中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示E-cadherin表達(dá)降低，Vimentin、Twist的表達(dá)升高，而N-cadherin未見明顯變化。
　　（4）與未用Gal-3刺激的巨噬細(xì)胞相比，Gal-3刺激后的

13、巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基與SW480細(xì)胞共培養(yǎng)后，可誘導(dǎo)SW480分泌至培養(yǎng)上清中CCL20和CXCL5的濃度明顯升高。
　　結(jié)論：
　?。?）微環(huán)境中的S100A8可能作為Gal-3的上游調(diào)控因子，可激活巨噬細(xì)胞中STAT3/IL-6信號通路上調(diào)Gal-3的表達(dá)。
　?。?）微環(huán)境中的Gal-3可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞分化。
　　（3）Gal-3激活后的巨噬細(xì)胞可以通過誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)其侵襲轉(zhuǎn)