間充質(zhì)干細(xì)胞對結(jié)腸癌靶向性及其生長影響的實驗研究.pdf

1、目的：
　　1.建立結(jié)腸癌的動物模型，了解裸鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤的病理改變。
　　2.通過對大鼠骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、純化、標(biāo)記及鑒定，為 MSCs進(jìn)行裸鼠結(jié)腸癌模型干預(yù)提供實驗基礎(chǔ)。
　　3.通過輸注骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞觀察裸鼠結(jié)腸癌組織中是否有間充質(zhì)干細(xì)胞，明確間充質(zhì)干細(xì)胞對結(jié)腸癌組織的靶向作用及對結(jié)腸癌組織生長的影響作用。
　　方法：
　　1.采用裸鼠皮下注射結(jié)腸癌細(xì)胞株Hct116方法建立裸鼠

2、結(jié)腸癌皮下移植瘤模型：將對數(shù)生長期的Hct116細(xì)胞,用0.25％的胰酶消化,PBS液吹打,1000轉(zhuǎn)/分室溫下離心，10min,棄上清,重復(fù)上述步驟3次后,用無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度至107/ml。細(xì)胞懸液搖勻后,用1 ml無菌注射器吸取細(xì)胞懸液0.2 ml(含2×106細(xì)胞)備用。消毒裸鼠右側(cè)腰部皮膚，將注射器內(nèi)細(xì)胞注射于右側(cè)腰部皮下。共注射20只。注射完畢后，連續(xù)觀察10天，待裸鼠右側(cè)腰部長出直徑大于5mm

3、的的皮下瘤，裸鼠結(jié)腸癌模型建立。將20只裸鼠裸鼠結(jié)腸癌模型按隨機數(shù)字表法分為2組，實驗組10只，對照組10只。
　　2.采用全骨髓差異貼壁法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）：將大鼠斷頸處死，在75%的酒精溶液中浸泡5min后于無菌環(huán)境下迅速取出雙側(cè)下肢,浸入含有雙抗的 PBS液中,洗滌并去除肌肉及附著軟組織,固定分離出的下肢長骨，剪刀減去兩端，用DMEM培養(yǎng)液2.5ml沖洗長骨骨髓腔，沖洗2-3次。將沖洗下來的含間充質(zhì)干細(xì)胞的懸液

4、于1000rp m下離心5min，倒掉上清液，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，接種于75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，并放于溫度37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天顯微鏡下觀察間充質(zhì)干細(xì)胞的生長情況。原代培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶面積約80%-90%時1:2或1:3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)至第3代時，胰酶消化貼壁細(xì)胞，并收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機檢測。
　　3.將獲取的MSCs進(jìn)行傳代、增殖及純化。第3代MSCs用一種羰花青熒

5、光染料CM-DiI(Chlormethylbenzamido-1，1 dioctadecyl-3，3，3ˊ，3ˊ-tetramethylindocarbocyamine)進(jìn)行標(biāo)記，在熒光顯微鏡下觀察并計算標(biāo)記率。再將標(biāo)記的MSCs制成細(xì)胞懸液，濃度為1×106/ml，于Hc t116細(xì)胞注射至裸鼠皮下第10天，將裸鼠結(jié)腸癌模型實驗組每只裸鼠尾靜脈注射2ml含1×106個標(biāo)記的MSCs細(xì)胞懸液，對照組每只裸鼠尾靜脈注射2ml生理鹽水。觀察

6、移植瘤生長情況，每3-4天同時測量兩組移植瘤瘤長、短徑，計算瘤體積，描繪腫瘤生長曲線，于移植MSCs14天，安樂死裸鼠，取皮下移植瘤，稱瘤重，計算抑瘤率。將取下的腫瘤組織行快速冰凍病理切片，通過熒光顯微鏡觀察腫瘤組織切片中是否含發(fā)熒光的陽性細(xì)胞；其余腫瘤組織行HE染色普通病理切片檢查，顯微鏡下觀察腫瘤組織的病理學(xué)變化。
　　結(jié)果：
　　1.裸鼠皮下注射結(jié)腸癌細(xì)胞株Hc t116后，于注射后第10天，裸鼠皮下均長出直徑大于5m

7、m的的皮下瘤。將結(jié)腸癌皮下移植瘤組織行病理切片HE染色可觀察到，移植瘤細(xì)胞為腺癌，癌細(xì)胞核大小不一，數(shù)量不等，存在多核瘤巨細(xì)胞，可見病理核分裂像，多彌漫呈片狀或巢狀，細(xì)胞內(nèi)充滿黏液樣分泌物。
　　2.原代接種24h后在顯微鏡觀察可見較多細(xì)胞貼壁，外觀呈紡錘形和多角形，3天之后細(xì)胞的數(shù)量開始增多，且形態(tài)發(fā)生變化呈成纖維細(xì)胞樣長梭形，9天之后細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶面積90％左右，此時細(xì)胞呈極性排列，集落呈漩渦狀。經(jīng)過多次換液以及2次傳代后，至

8、第3代時，細(xì)胞趨于純化，形態(tài)均一，呈膜狀鋪展。細(xì)胞表面標(biāo)記物經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，CD29陽性率為98.6%、CD90陽性率99.6%；而CD34、CD45為陰性，陽性率分別為0.56％、0.89%。
　　3.驗組皮下移植瘤組織體積與對照組皮下移植瘤組織體積之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；實驗組瘤重與對照組瘤重之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗組皮下瘤冰凍病理切片組織于熒光顯微鏡下觀察可見發(fā)紅色熒光C M-DiI陽性