人關(guān)節(jié)液對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的: 體外獲得人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymalstem cells，hBMSCs)，并對獲取的hBMSCs進(jìn)行純化、擴(kuò)增及鑒定。通過人關(guān)節(jié)液與hBMSCs混合培養(yǎng)，研究共培養(yǎng)系統(tǒng)導(dǎo)致hBMSCs定向誘導(dǎo)分化的影響，探討關(guān)節(jié)液對hBMSCs的作用，為以關(guān)節(jié)液和BMSCs作為軟骨組織工程基質(zhì)的使用奠定一定的基礎(chǔ)。
　　 方法: 從因創(chuàng)傷導(dǎo)致不同部位的骨折需行骨折復(fù)位及髂骨植骨術(shù)的志愿者

2、中，獲取骨髓，采用全骨髓、貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)和分離hBMSCs。在實(shí)驗(yàn)過程中，我們還對培養(yǎng)的hBMSCs進(jìn)行了凍存和復(fù)蘇。實(shí)驗(yàn)在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長形態(tài);取生長狀態(tài)良好的P3代細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)志物的表達(dá)和細(xì)胞表型的鑒定;取生長狀態(tài)良好的P1、P2、P3代細(xì)胞，分別用胰蛋白酶消化、培養(yǎng)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，繪制hBMSCs生長曲線圖。在無菌操作下，患者取坐位，雙膝下垂，穿刺部位按常規(guī)進(jìn)行皮膚消毒，用2％利多卡因作局部麻醉，于

3、健康志愿者的膝關(guān)節(jié)的髕骨下緣、髕韌帶外側(cè)1cm處，定位后用一次性10號(hào)注射針頭與脛骨平臺(tái)平行，向內(nèi)呈45度角,穿刺進(jìn)入，針頭完全刺入即可，抽取膝關(guān)節(jié)內(nèi)的關(guān)節(jié)液，將其與生長良好的P3細(xì)胞混合用于實(shí)驗(yàn)，將24孔板盲法隨機(jī)分為3組（A組、B組及C組），每組8孔，每個(gè)孔板內(nèi)放置無菌并用多聚賴氨酸預(yù)處理過的爬片，其中:A組:單純關(guān)節(jié)液組（關(guān)節(jié)液+含體積分?jǐn)?shù)10％FBS+1％雙抗的HG-DMEM）;B組:關(guān)節(jié)液+hBMSCs組（關(guān)節(jié)液+hBMSCs

4、+含體積分?jǐn)?shù)10％FBS+1％雙抗的HG-DMEM）;C組:單純hBMSCs組(hBMSCs+含體積分?jǐn)?shù)10％FBS+1％雙抗的HG-DMEM)。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化和生長情況，分別于誘導(dǎo)后第7，14，21天行甲苯胺藍(lán)染色檢測酸性糖胺多糖表達(dá)，免疫組化染色檢測細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)。
　　 結(jié)果: 經(jīng)全骨髓、貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)分離獲得了純度較高h(yuǎn)BMSCs，細(xì)胞呈均一的長梭形、短梭形及多角形，漩渦狀或輻射狀結(jié)構(gòu)，繪制的生長曲

5、線呈S形。所分離培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD105分別為:99.6％、100％、99.4％、92.5％，呈均一、高表達(dá)性;而表達(dá)CD34、CD45分別為:0.5％、0.6％，呈低表達(dá)性。hBMSCs與關(guān)節(jié)液混合培養(yǎng)后，細(xì)胞增殖速度減慢，由長梭形變?yōu)槎嘟切?、橢圓形，細(xì)胞外基質(zhì)呈甲苯胺藍(lán)異染性陽性，Ⅱ型膠原免疫組化陽性，表現(xiàn)出向關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分化的特點(diǎn)。
　　 結(jié)論: 全骨髓、貼壁培養(yǎng)法可成功分離hBMSCs，該方