成肌細胞促進骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化及其機制的實驗研究.pdf

1、本研究采用與成肌細胞共同培養(yǎng)的方式，模擬體內(nèi)的成肌微環(huán)境，促進MSCs的成肌分化及其移植效率的提高。通過移植共同培養(yǎng)后的細胞，尋找提高MSCs移植效率的新途徑，為將來的臨床應用奠定理論基礎。同時，初步研究在共同培養(yǎng)條件下，成肌細胞促進MSCs成肌性分化的可能機制。 1.材料和方法1.1實驗動物SD大鼠作為MSCs供體鼠，正常野生型C57鼠作為正常對照，未經(jīng)移植的mdx鼠作為陰性對照，將mdx鼠下肢肌肉(脛前肌和腓腸肌)的左右側分

2、別作為共同培養(yǎng)組和單獨培養(yǎng)組細胞局部注射移植處。選取6-8周齡的mdx鼠進行移植，分別于移植后2、4、8、12和16周取材。在細胞移植過程中死亡的mdx鼠退出試驗，保持各組和各時間點動物為3只左右。 1.2MSCs、HEK293細胞和C2C12成肌細胞的培養(yǎng)取SD大鼠骨髓做原代培養(yǎng)，再用差速貼壁法分離、擴增及純化MSCs，再用流式細胞儀(FCM)進行表面抗原鑒定，將形態(tài)一致的P4-6代MSCs用于移植。當293細胞生長至70～8

3、0％融合時，可用于Ad-eGFP的擴增。C2C12成肌細胞生長至70～80％融合時，可傳代或用于共同培養(yǎng)。 1.3Ad-eGFP的擴增、純化、鑒定和轉染 當接種過構建有增強型綠色熒光蛋白腺病毒(Ad-eGFP)的293細胞出現(xiàn)病變效應(CPE)后，可以收獲病毒。用CsCl2梯度離心法純化病毒，用TCID50檢測方法測定病毒滴度。提取病毒DNA，進行E2b區(qū)的PCR檢測。按照感染復數(shù)的不同分別接種相應劑量的Ad-eGFP，

4、用FCM檢測轉染效率。 1.4MSCs和C2C12成肌細胞的共同培養(yǎng) 將轉染eGFP后的MSCs與C2C12成肌細胞按照10∶1的比例接種，用含有2％馬血清的DMEM培養(yǎng)。 1.5誘導分化后MSCs中成肌調(diào)節(jié)因子表達的RT-PCR、WesternBlot和免疫熒光檢測 分別選取誘導分化后第1、3、5和7天的共同培養(yǎng)組和單獨培養(yǎng)組細胞，做MyoD和Myogenin表達的RT-PCR、WesternBlot和

5、免疫熒光檢測，并比較兩組之間的統(tǒng)計學差異。 1.6誘導分化后MSCs胞漿中鈣離子濃度變化的激光共聚焦檢測分別選取誘導分化后48h的共同培養(yǎng)組和單獨培養(yǎng)組的MSCs，用Fluo3標記鈣離子，用激光共聚焦顯微鏡先掃描得到基線熒光強度之后，再添加nicotine，繼續(xù)檢測細胞內(nèi)熒光強度的變化。 1.7將mdx鼠預先放療后進行局部肌肉注射性的細胞移植首先預先放療mdx鼠，再將共同培養(yǎng)組和單獨培養(yǎng)組細胞分別多點注射注射到mdx鼠的

6、單側肌肉(脛前肌和腓腸肌)，注射總量為0.4ml，移植細胞總數(shù)約為1×106個。 1.8肌肉組織HE染色分別選取移植后2，4，8，12和16周的共同培養(yǎng)組和單獨培養(yǎng)組肌肉的冰凍切片進行常規(guī)HE染色，在鏡下觀察細胞形態(tài)，并計算細胞核中心移位肌纖維的比例。 1.9移植后肌肉中成肌調(diào)節(jié)因子和相關蛋白表達的RT-PCR、WesternBlot和免疫熒光檢測 分別選取移植共同培養(yǎng)組和單獨培養(yǎng)組細胞后第2、4、8、12和16

7、周的肌肉，進行成肌調(diào)節(jié)因子和相關蛋白表達的RT-PCR、WesternBlot和免疫熒光檢測，并比較兩組之間的統(tǒng)計學差異。 1.10統(tǒng)計學分析所有統(tǒng)計學數(shù)據(jù)采用SPSS11.0進行分析，差異在統(tǒng)計學上有顯著性意義的水平為P＜0.05。 2.結果2.1MSCs、HEK293細胞和C2C12成肌細胞的形態(tài)學和生長特點MSCs為貼壁性的細胞，經(jīng)傳代3代以上趨于純化，多數(shù)呈均一典型的紡錘狀成纖維樣細胞形態(tài)。經(jīng)FCM檢測，其中CD

8、11b和CD45表達陰性，而CD29和CD44表達陽性。HEK293細胞呈現(xiàn)出上皮樣貼壁生長，生長迅速。C2C12成肌細胞表現(xiàn)為成纖維細胞樣生長，在使用誘導分化培養(yǎng)基以后，生長減慢，開始分化，并表達成肌調(diào)節(jié)因子。 2.2Ad-eGFP擴增、鑒定并轉染MSCsAd-eGFP在轉染293細胞36-48h出現(xiàn)CPE，表現(xiàn)為：90％以上的細胞腫脹變圓并離散，部分聚集呈葡萄狀，10～20％的細胞漂浮。提取病毒DNA，進行E2b區(qū)的PCR鑒

9、定，得到一條861bp的產(chǎn)物，提示腺病毒結構完整。當MOI分別為10、20、50、100、150、200、300、400和500的時候，經(jīng)FCM檢測，相應的轉染率依次為48.7、64.8、72.1、89.1、89.9、93.1、94.4、95.8和96.8(％)，MOI從10-100時候，轉染率增加最顯著，隨后盡管大幅度增加病毒的劑量，但其轉染效率不再明顯增加，同時細胞病變明顯，脫落細胞增多，因此在本研究中，以100作為最佳的MOI來感

10、染MSCs。在轉染24h后，eGFP的表達最為穩(wěn)定。 2.3誘導分化后MSCs中成肌調(diào)節(jié)因子表達的RT-PCR檢測在共同培養(yǎng)組中，MyoD于第3天表達量最高，在單獨培養(yǎng)組中，于第1和第3天表達量相對較高。兩組均在第5天時顯著下降，至第7天時僅有少量表達。在兩組細胞中，Myogenin的表達量在第1和第3天都很少，在第5天顯著提高，在第7天時下降。兩組之間表達量的差別在統(tǒng)計學上有顯著性意義。 2.4誘導分化后MSCs中成肌

11、調(diào)節(jié)因子表達的WesternBlot檢測在兩組中，MyoD的表達均于第3和第5天達到高峰。Myogenin的表達均于第1天開始就逐漸升高，在第5和第7天時達到高峰。兩組之間表達量的差別在統(tǒng)計學上有顯著性意義。 2.5誘導分化后MSCs中成肌調(diào)節(jié)因子表達的免疫熒光檢測將兩組MSCs誘導分化至第3天，分別計算MyoD和Myogenin表達的陽性率。前者在共同培養(yǎng)組為11.8％，單獨培養(yǎng)組為2.7％。后者在共同培養(yǎng)組5.4％，單獨培養(yǎng)

12、組為3.3％。 2.6誘導分化后MSCs胞漿中鈣離子濃度變化的激光共聚焦檢測在先后加入10μl和50μl濃度為1M煙堿后，兩組細胞內(nèi)標記鈣離子的熒光信號強度開始不同程度的升高(但也有個別細胞表現(xiàn)為下降)，然后呈現(xiàn)為緩慢下降的趨勢。其中在加入10μl的時候，熒光信號強度在兩組之間的差別在統(tǒng)計學上有顯著性差異。而在第2次加50μl的煙堿后，上述差別在統(tǒng)計學上無顯著性差異。2.7肌肉的組織病理 正常C57鼠肌肉細胞呈多角形，形

13、態(tài)基本一致，輪廓清晰、完整，肌細胞核位于細胞周邊，未見有胞核中移現(xiàn)象，無炎性細胞浸潤；肌纖維間隙正常，肌內(nèi)束、肌間束結構完整。在移植后mdx鼠的肌肉中，均有較多的炎性細胞浸潤，肌細胞橫截面積大小不一，有萎縮和肥大細胞，肌細胞失去多角形形態(tài)，變成圓形，脂肪和纖維組織浸潤不明顯，而肌細胞核中心移位明顯，但同時有少量的新生肌纖維的再生。未治療組mdx鼠CNF可達60％，在移植后2、4、8、12和16周后，共同培養(yǎng)組分別為56.7、52.1、5

14、0.3、45.6和41.6(％)，而單獨培養(yǎng)組分別為57.1、55.6、52.1、50.3和45.5(％)。 2.8移植后mdx鼠肌肉中成肌調(diào)節(jié)因子表達的RT-PCR檢測在mdx鼠中有MyoD和Myogenin的少量表達，二者隨著移植時間延長表達量逐漸增多，在移植后第8周表達量最高，然后緩慢下降。兩組之間的差別在統(tǒng)計學上有顯著性意義。 2.9移植后mdx鼠肌肉中成肌調(diào)節(jié)因子表達的WesternBlot檢測MyoD和Myo

15、genin的表達均隨移植時間延長而逐漸增多，前者在移植后第8周，后者在第12周表達量最多，16周時仍持續(xù)表達。兩組之間的差別在統(tǒng)計學上有顯著性意義。 2.10移植后mdx鼠肌肉中成肌調(diào)節(jié)因子及相關蛋白表達的免疫熒光檢測MyoD在正常C57鼠中沒有表達，未治療mdx鼠的陽性率為5％；在移植后的2、4、8、12和16周，共同培養(yǎng)組分別為6、12、20、15和10(％)，單獨培養(yǎng)組分別為6、10、15、12和8(％)。Myogenin

16、在正常C57鼠沒有表達，未治療mdx鼠的陽性率為7％；在移植后的2、4、8、12和16周，共同培養(yǎng)組分別為8、15、23、18和15(％)，單獨培養(yǎng)組分別為7、10、18、15和10(％)。MHC在正常C57鼠肌細胞無表達，未治療mdx鼠的陽性細胞比例小于1％；在移植后的2、4、8、12和16周，共同培養(yǎng)組分別為5、15、18、23和20(％)，單獨培養(yǎng)組分別為3、10、15、18和15(％)。mdx鼠肌肉細胞膜上基本無dystroph

17、in表達；在移植后的2、4、8、12和16周，共同培養(yǎng)組分別為3、5、9、13和17(％)，單獨培養(yǎng)組分別為2、4、7、12和15(％)。 3.結論3.1構建有增強型綠色熒光蛋白的腺病毒可以有效轉染骨髓間充質(zhì)干細胞，在后者的成肌分化過程中起到示蹤的作用。 3.2與成肌細胞共同培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞可以高效表達成肌調(diào)節(jié)因子；提示共同培養(yǎng)中的成肌細胞可以在一定程度上構建成肌微環(huán)境，加速骨髓間充質(zhì)干細胞的定向分化。 3